Resultados inducción de proteína recombinante Mayo, 2017

Sistema de expresión Consiste en un conjunto de elementos genéticos configurados de manera óptima para el control de la transcripción y traducción de las secuencias a expresar. En Escherichia coli está constituido por dos componentes: una bacteria huésped y un vector de expresión que posee los elementos génicos necesarios para realizar los procesos de transcripción y traducción en dicha bacteria: el origen de replicación, que influye en el número máximo de copias del vector de expresión por cada célula, las características de las secuencias de inicio y final de la transcripción, entre las que se incluyen los promotores y terminadores, las señales de comienzo de la traducción, como son el codón de inicio de la traducción y los sitios de unión al ribosoma, la localización subcelular de la proteína que se va a expresar (citoplasma o periplasma) y el control de la segregación plasmídica. En la segregación plasmídica es de gran importancia el mecanismo de retención del vector en la célula. El mecanismo clásico para evitar el inconveniente de la segregación es la coexpresión en el vector de un gen codificante para la resistencia a un marcador de selección, generalmente un antibiótico, de manera que únicamente la células que posean en su interior el vector serán capaces de propagarse en un medio de cultivo que contenga el marcador de selección.

Inducción de la expresión en E. coli La cepa de Escherichia coli más utilizada en los sistemas de expresión es la BL21, debido a que es defectiva en las proteasas OmpT y Lon, involucradas en la degradación de proteínas. En función del sistema de expresión empleado, la cepa puede contener el módulo regulador de la expresión integrado en el cromosoma. Sistema de expresión pET (Novagen) la cepa de expresión contiene el ADN del bacteriófago DE3 integrado en el cromosoma. Este bateriófago contiene a su vez el gen codificante de la T7 RNA polimerasa regulado por el promotor lacUV5 cuya actividad se induce por medio de la adición de IPTG (Isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside). En este sistema, el vector de expresión pET utilizado para la expresión de la secuencia codificante de la proteína de interés, incorpora una región promotora reconocida por la T7 RNA polimerasa, de manera que tras la adición del IPTG, la T7 RNA polimerasa expresada desde el cromosoma bacteriano induce la expresión de la proteína a partir del vector.

SeeBlue Plus2 Preteñido (Invitrogen) Std de peso molecular SeeBlue Plus2 Preteñido (Invitrogen)

Si hubo inducción tienen dos bandas preferentes en todos los geles. EQ3 y EQ4 EQ1 y EQ2 Std 0 20 30 40 0 20 40 60 0 20 30 40 Std 0 20 40 60 250 140 98 64 50 36 22 16 250 140 98 64 50 36 22 16 Chicos, Si hubo inducción tienen dos bandas preferentes en todos los geles. Calcular peso molecular de las bandas producidas Tuvimos expresión en el tiempo cero!!?? Cargamos dos veces el gel, hubo algún error en el cargado? Buscar porqué sin inductor puede haber producción de proteína EQ5 y EQ6 0 20 30 40 Std 0 20 40 60 250 140 98 64 50 36 22 16