“Uso de soportes heterofuncionales para la RIDIFICACIÓN dirigida de proteínas“

METODOS DE INMOVILIZAICON A ESCALA LABORATORIO A ESCALA INDUSTRIAL MMEJORA DE LAS PROPIEDADES POR INMOVILIZACION A ESCALA LABORATORIO MEJORA DE LAS PROPIEDADES POR INMOVILIZACION A ESCALA INDUSTRIAL

METODOS DE INMOVILIZAICON A ESCALA LABORATORIO A ESCALA INDUSTRIAL MMEJORA DE LAS PROPIEDADES POR INMOVILIZACION A ESCALA LABORATORIO MEJORA DE LAS PROPIEDADES POR INMOVILIZACION A ESCALA INDUSTRIAL

SOPORTES EPOXIDO ESTABILIZACION DE PGA

.. Inmovilización de proteínas sobre soportes epóxido. Sistema “casi-ideal” para inmovilizaciones industriales HO HS NH2 .. grupos epóxido muy estables inmovilización multipuntual resinas epoxi-acrílicas... soportes directamente activados. Inmovilización extremadamente lenta

Método estándar de inmovilización PGA a soportes epóxido 1M fosfato pH 7.0 NH2 .. pH 7.0 Adsorción física (hidrofóbica) Inmovilización covalente pH 7,8 Bloqueo con Unión multipuntual ??................OPTIMIZACIÓN !!!!

Resinas epoxiacrílicas macroporosas EUPERGIT SEPABEADS Copolimerización muy intensa en presencia de agentes porogénicos (disolventes orgánicos) Copolimerización poco intensa Unión multipuntual ??

de derivados PGA-soportes epóxido Inactivación térmica de derivados PGA-soportes epóxido 100 pH 8.0, 45 ºC 75 EUPERGIT % Actividad Remanente 50 SEPABEADS 25 1 2 3 4 5 6 Tiempo (h)

Inactivación de enzimas por superficies hidrofóbicas

Bloqueo de soportes epóxido con reactivos muy hidrofílicos

Inactivación térmica de derivados PGA-Sepabeads (epóxido) Bloqueo final de los derivados 100 80 60 “hidrofilización” % Actividad Remanente 40 20 pH 8.0, 45 ºC 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Tiempo (h) derivados bloqueados con mercaptoetanol derivados sin bloquear derivados bloqueados con etilendiamina derivados bloqueados con aspártico derivados bloqueados con etanolamina derivados bloqueados con glicina

Inactivación térmica de PGA soluble y de los mejores derivados sobre soportes epóxido 45 ºC 25 50 75 100 2 4 6 8 Tiempo (h) % Actividad Remanente Sepabeads Eupergit Soluble 55 ºC 25 50 75 100 2 4 6 8 Tiempo (h) % Actividad Remanente Sepabeads Eupergit Sepabeads (80 mEqs/ml), inmovilización. a pH 8.0 (1 M fosfato) incubación a pH 9.0 durante 4 días a baja fuerza iónica bloqueo final con 3 M de glicina a pH 8.5

INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS SOBRE SOPORTES EPÓXIDO HETEROFUNCIONALES inmovilizaciones más sencillas y universales nuevas orientaciones de la enzima inmovilizada

Métodos más universales de inmovilización sobre soportes-epóxido Adsorción hidrofóbica + Inmovilización covalente Sólidos hidrofóbicos Alta fuerza iónica bolsillos hidrofóbicos en la superficie de la enzima REACCION CON LOS GRUPOS NUCLEOFILOS DE ESA ZONA NH2 .. Métodos más universales de inmovilización sobre soportes-epóxido

NH2 CH2 EDA m - APB IDA NH COOH COOH CuSO4

Efecto de la modificación, adsorción e inmovilización covalente + Suficientes grupos nuevos para favorecer la adsorción y muchos grupos epóxido fácilmente accesibles para favorecer la inmovilización covalente

pH 7, 25ºc Inmovilización covalente de proteínas de un extracto crudo de Escherichia coli en diferentes soportes epóxido hetero-funcionales Eupergit Cu boronato -COO- -NH3+ Proteína inmovilizada 70% >85% 75% <10% 65% pH 7, 25ºc SOPORTE Un alto porcentaje de proteínas se pueden inmovilizar sobre diferentes soportes .... diferentes orientaciones La utilización secuencial de 3 soporten permite la inmovilización de “todas” las proteínas del extracto

Zona de inmovilización Zonas con mayor densidad de carga negativa ORIENTACIÓN DE ENZIMAS SOBRE SOPORTES EPÓXIDO MULTIFUNCIONALES R Zona de inmovilización Zonas con mayor densidad de carga negativa Zonas con mayor densidad de carga positiva Cadenas glicosiladas Zonas con mayor densidad de histidinas COO- Cu +2

Purificación, inmovilización y estabilización de enzimas recombinantes con poli-His COO - Co +2 adsorción selectiva inmovilización covalente incubación a pH alcalino bloqueo con reactivos hidrofílicos

—Subunidad grande —Subunidad pequeña 1 2 3 5 6 4 inmovilización selectiva e inmovilización multipuntual glutaril acilasa fusionada con poli-His 1.- proteínas ofrecidas 2.- proteínas no inmovilizadas Desorción hirviendo los derivados con SDS + SDS-PAGE del sobrenadante —Subunidad grande —Subunidad pequeña 1 2 3 5 6 4 3.- derivado inmovilizado 6.- derivado incubado a 24 h a pH alcalino

INMOVILIZACIÓN DIRIGIDA + RIGIDIFICACIÓN Estabilización con cualquier orientación Orientación con mayor estabilización - proximidad al centro activo - proximidad a bolsillos hidrofóbicos - rodeada de la mayor cantidad de Lys Rigidificación cercana al centro activo - alteración de cambios conformacionales implicados en la catálisis

INACTIVACION DE UNA BETA-GALACTOSIDASA NMOVILZADA SOBRE DIFERENTES SOPORTE MULTIFUNCIUONALES 20 40 60 80 100 Residual Activity, (%) Time (hours)

MODULACIÓN DE LAS PROPIEDADES DE LIPASAS POR INMOVILIZACION DIRIGIDA

Activación Interfacial Introducción Activación interfacial en presencia de interfases Conformación cerrada Conformación abierta Cara externa del Lid Sitio activo Cara interna del Lid zona hidrofóbica zona hidrofílica Interfase hidrofóbica Activación Interfacial

estructuras hidrofóbicas Introducción Diferentes conformaciones de lipasas Lid Lid Completamente inaccesible a los sustratos Abierta en presencia de sustratos o estructuras hidrofóbicas Conformación cerrada e inactiva Conformación abierta

Mecanismo de acción de las lipasas en ausencia de interfases Introducción Mecanismo de acción de las lipasas en ausencia de interfases Evidencias experimentales: Lipasas muestran actividad esterásica en ausencia de interfases 1ª HIPOTESIS: Equilibrio Conformacional zona hidrofóbica zona hidrofílica

Métodos de inmovilización, T, pH, disolvente Introducción Cambio Conformacional de las estructuras abierta y cerrada de lipasas Posibles cambios conformacionales en las regiones vecinas Interacción Desfavorable  Gran bolsillo hidrofóbico expuesto al medio Interacción Favorable  Cara externa del “lid” y el bolsillo donde se aloja Interacciones hidrofóbicas Bolsillo hidrofóbico Interacciones puentes hidrógeno y puentes salinos 2ª Hipótesis Métodos de inmovilización, T, pH, disolvente Podría afectar forma exacta del centro activo Selectividad

Modificación del mecanismo de apertura: Ingeniería Conformacional Ingeniería del derivado Distancia entre enzima-soporte Diferente Rigidez Diferente orientación Microambiente hidrofílico Adsorción Interfacial

Efecto de las condiciones experimentales sobre la selectividad: Modulación selectividad lipasas Efecto de las condiciones experimentales sobre la selectividad: Ingeniería del medio Interacciones hidrofóbicas Bolsillo hidrofóbico Interacciones puentes hidrógeno y puentes salinos Temperatura: modificando movilidad de la enzima pH: Alteración de interacciones entre lid y bolsillo receptor; superficie de proteína Disolventes: Exposición del bolsillo hidrofóbico (menos desfavorable) y refuerzan las interacciones electrostáticas

Hidrólisis enantioselectiva del (±)-Mandelato de Metilo catalizada Modulación selectividad lipasas Hidrólisis enantioselectiva del (±)-Mandelato de Metilo catalizada por derivados de CAL-B + H2O (±)-Mandelato de Metilo (R)-ácido mandélico 10 mM,25ºC, pH 7 Derivado inmovilizado Enantiómero hidrolizado ee E BrCN-CAL-B R 73 7,4 Octadecil-CAL-B 82 12 Glioxil-CAL-B 88 19 Eupergit-Cu-CAL-B 89 20 PEI-CAL-B 96,5 67 ee= exceso enantiomérico de sustrato al 15% de conversión; E=enantioselectividad

Hidrólisis enantioselectiva del ácido (±)- 2-O-butiril-2-fenilacético Modulación selectividad lipasas Hidrólisis enantioselectiva del ácido (±)- 2-O-butiril-2-fenilacético catalizada por derivados inmovilizados de BTL2 O H O H C O H H2O (R,S) + O H H O C + 0,5 mM,4ºC, pH=9 Derivado inmovilizado Enantiómero hidrolizado ee E Glioxil-BTL2 R 70 6,4 Octadecil-Sepabeads-BTL2 >99 >100 PEI-BTL2 S 81 9,3 ee= exceso enantiomérico de sustrato al 15% de conversión; E=enantioselectividad

Modulación selectividad lipasas Efecto de las condiciones experimentales sobre la selectividad de lipasas:Efecto de la Temperatura (±)-Mandelato de metilo (R)-Ácido mandélico + H2O glioxil PEI Temperatura(ºC) 20 40 60 Enantioselectividad (E) pH 7, CAL-B

Modulación selectividad lipasas Efecto de las condiciones experimentales sobre la selectividad de lipasas:Efecto del pH pH 5 pH 7 R- Ácido mandélico S-Ácido mandélico O H C H2O (R,S) + 25ºC, TAL 5 7 Enantioselectividad (E) 4 8 12 pH glioxil Octadecil

INMOVILIZACIÓN DIRIGIDA + RIGIDIFICACIÓN Estabilización con cualquier orientación Orientación con mayor estabilización - proximidad al centro activo - proximidad a bolsillos hidrofóbicos - rodeada de la mayor cantidad de Lys Rigidificación cercana al centro activo - alteración de cambios conformacionales implicados en la catálisis

VENTAJAS DE LA INMOVILIZACION ORIENTADA Enzimas o proteínas que actúan sobre substratos o ligandos macromoleculares H2O2 Protección de sitios sensibles a agentes oxidantes, inhibidores alostéticos Inmovilización multipuntual muy intensa: Zona más rica en Lys Modulación de cambios conformacionales implicados en la catálisis