Industria Química Enzimas Enzimas para la industria Química LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES EN LA INDUSTRIA QUÍMICA Industria Química Enzimas Enzimas para la industria Química MODIFICACIÓN Y MEJORA DE SUS PROPIEDADES BIOTECNOLOGÍA E INGENIERIA ENZIMÁTICA MEJORA DE ENZIMAS PARA AUMENTAR SUS POSIBILIDADES DE UTILIZACIÓN EN PROCESOS INDUSTRIALES

INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS Enzima soluble Enzima inmovilizada Soporte + E Re-uso o uso continuo Control de la reacción más sencillo Proceso más limpio INMOVILIZACIÓN MEJORAR LAS PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS

VENTAJAS USO ENZIMAS INMOVILIZADAS Mejor control de la reacción y del reactor Re-uso del derivado durante varios ciclos Posibilidad de aumentar la concentración de la enzima en la reacción No contaminación del producto por la enzima Estabilización??? COSTE....... PROCESO DE INMOVILIZACION + SOPORTE

chemical modification INACTIVATION OF ENZYMES pH 7.0, 4ºC dissociation conformational changes aggregation heat pH hydrophobic interfaces hydrolysis by proteases chemical modification

IMMOBILIZATION OF ENZYMES: EFFECTS ON OPERATIONAL STABILITY no real ?? rigidification 3D No aggregation No proteolysis No interaction with interfaces porous supports FNR stabilization by pure immobilization pH7, no stirring pH7, stirring pH5, no stirring pH7, biphasic system with stirring experimetal condition stabilization 1 10000 2500 1000

Sustratos insolubles Sustratos muy grandes LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES SOLUBLES Reuso ? Proteolisis Agregación Interacción con interfase Sustratos insolubles Sustratos muy grandes

S P S S S S S S S REACTORES DE ULTRAFILTRACION La enzima soluble puede reusarse Todos los mecanismos de inactivación son posibles S S S S

INACTIVACION DE ENZIMAS POR SUPERFICIES HIDROFOBICAS

INFLUENCE OF THE HYDROPHILIC SHELL ON DAO INACTIVATION COURSES IN THE PRESENCE OF HYDROPHOBIC INTERFACES UNDER STRONG AGITATION. S P P S P S S P S P S S P S P P : soluble DAO (0.04 IU/mL). : DAO-dextran (20000 Mw) conjugate (0.04 IU/mL) : Control without agitation P

: soluble Trypsin (0.5 IU/mL). INFLUENCE OF THE HYDROPHILIC SHELL ON TRYPSIN INACTIVATION COURSES IN THE PRESENCE OF HYDROPHOBIC INTERFACES : soluble Trypsin (0.5 IU/mL). : Trypsin-dextran (20000 Mw) conjugate (0.5 IU/mL) : Control without agitation. The experiment was carried out at 4ºC in n-heptane saturated buffer under strong agitation

INFLUENCE OF THE HYDROPHILIC SHELL ON TRYPSIN INACTIVATION COURSE : Trypsin-dextran (20000 Mw) conjugate (0.04 IU/mL) : Control without agitation.

Todo el sólido es proteína No hay gasto de soporte DERIVADOS SIN SOPORTE Todo el sólido es proteína No hay gasto de soporte Estabilización operacional Rigidificación ? Microambiente ?

POSIBILIDADES CLECs Enzimas puras y cristalinas Crosslinked Enzyme Crystals Crosslinked Enzyme Aggregates CLECs Enzimas puras y cristalinas Necesidad de enzima pura Estabilizacion de proteinas multimericas CLEAs Enzimas con trazas de impurezas Coagregacion de enzimas Agregacion de enzima y polimero Estabilizacion de enzimas

Propiedades mecánicas independientes de la enzima INMOVILIZACION DE ENZIMAS SOBRE SOPORTES PREEXISTENTES Propiedades mecánicas independientes de la enzima Posibilidad de unión covalente multipuntual Sustratos grandes Gasto soporte Residuos despues de la inactivación

INMOVILIZACION POR ADSORCION Protocolos de inmovilzación sencillos El soporte puede regenerarse cuando la enzima se inactiva Reducción de residuos Riesgo de liberación de la enzima al medio de reacción Estabilización??

Sistema ideal para la inmovilización reversible de enzimas Adsopción fuerte y no distorsionante Adsorción en soportes recubiertos de Polímerosiónicos polifuncionales??? Muchos grupos en el soportes La proteína puede “embeberse” en la cama Inmovilización multipuntual El polímero se adapta a la enzima En vez de forzar a la enzima a adaptarse al soporte

+ Enzyme + Polyethyleneimine

DESORPTION OF INVERTASE FROM ANIONIC EXCHANGER SUPPORTS + pH 7, 25ºC + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + PEI-support DEAE-support

anionic exchangers at growing ionic strength Desorption of IMAC/b-galactosidase of Thermus sp strain T2 from different anionic exchangers at growing ionic strength Desorbed activity, (%) [NaCl], (mM)  Activity released from DEAE (after 30 min of being adsorbed)  Activity released from PEI Experimental conditions: pH 7, 25ºC

Thermal stability of IMAC/b-galactosidase of PEI derivatives from Thermus sp strain T2  Soluble enzyme  PEI derivative Residual activity, (%) Time (h) Experimental conditions : pH 7, 70ºC

REUSE OF THE PEI-COATED SUPPORT + + + + + + + + + ENZYME INACTIVATION + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + WASHING AT 10 mM HCl AT 40ºC WASHSING IN 9 M GUANIDINE OR UREA AT 40ºC IMMOBILIZATION OF FRESH ENZYME NEW ACTIVE BIOCATALYST

INMOVILIZACION SOBRE ANTICUERPOS Inmovilización / purificación en una etapa Orientación de la proteína Unión reversible Estabilización

V V DOMINOS POR INMOVILIZACION Gen + dominio gen Proteina nativa Proteina con el dominio V V Soporte con dominio de actividad Inmovilizacion soluble Inmovilizacion reversible

Útil cuando la enzima requiere ser estabilizada UNION COVALENTE Posibilidad de estabilización por unión multipuntual La unión de la enzima al soporte es muy fuerte Tras inactivación hay que eliminar el soporte y la enzima Útil cuando la enzima requiere ser estabilizada previa a su utilización

Very slow intermolecular covalent immobilization IMMOBILIZATION ON EPOXY SUPPORTS H2N Very slow intermolecular covalent immobilization HS HO pH 7.0, 4-25 °C Mild physical adsorption plus H2N very fast intramolecular covalent binding

IMMOBILIZATION AT LOW-IONIC STRENGTH IMMOBILIZATION AT HIGH-IONIC STRENGTH

Sub-optimal immobilization rates NH3+ H2N “rapid” Covalent attachment Slow physical adsorption NH3+ NH3+ O HN NH3+ O HN “slow” Covalent attachment NH3+ NH3+ H2N Rapid Physical adsorption Sub-optimal immobilization rates

“Rapid covalent attachment” NH2+ NH2+ H2N - H2N - “Rapid adsorption” of the protein “ High density of Amine groups” “ High density of Epoxy groups” NH2+ N2H NH - NH2+ NH - Intense Multipoint covalent attachment?? “Rapid covalent attachment”

ESTABILIZACION POR INMOVILIZACIÓN PURA No hay agregación No hay interacción con interfases No hay posibilidad de proteolisis Las burbujas de gas o gotas de disolvente no pueden penetrar en los poros Las moléculas de enzima estan dispersas

SOLIDOS NO POROSOS La superficie especifica depende del tamaño de la partícula Tamaños muy pequeños no pueden manejarse No protege de interfases o proteolisis Utiles para todo tipo de sustratos Partículas magnéticas magneto

Modificación propiedades Vidrio de poro controlado SOL-GELES Polimerización y “curado” UV, Tª Estabilización Modificación propiedades Vidrio de poro controlado con la enzima atrapada

LABORATORIO FRENTE A INDUSTRIA Reactivos TÓXICOS o inflamables Soportes activados con grupos inestables (procesos rápidos) Protocolos complejos Procesos limpios y sencillos Posibilidad de almacenar el soporte activado antes de usar No utilización de reactivos peligrosos

INMOVILIZACION DE ENZIMAS Interdisciplinaridad e Integración Nuevos Materiales  soportes con mejores propiedades Técnicas de Biología Molecular  dominios de afinidad Química de Superficies Química de Proteínas Interacción Proteínas – Superficies MUCHOS PROBLEMAS DIFERENTES – MUCHAS SOLUCIONES