Alta actividad volumétrica PURIFICACION DE ENZIMAS E2 E2 E3 Reacción a evitar Reacción deseada Alta actividad volumétrica Reacciones indeseables Oxidaciones… Hidrólisis…
PURIFICACION DE ENZIMAS A ESCALA LABORATORIO Adsorción de todas las enzimas (1mg de muestra enzima/ml) Desorción selectiva de nuestra enzima Varios procesos cromatográficos… No importa tiempo ni dinero
- SDS – PAGE ELECTROFORESIS Las proteínas se separan por tamaño + SDS 100ºC - -galactosidase pura 1 2 3 4 94 67 43 30 20 kDa Las proteínas se separan por tamaño Criterio de pureza: Una única banda
PURIFICACION DE ENZIMAS Muchas proteínas aparentemente similares Intracelulares Pocas proteínas La enzima de interés es mayoritaria Extracelulares Biología molecular
PURIFICACION INDUSTRIAL DE ENZIMAS Métodos sencillos, rápidos y baratos Pocos pasos cromatográficos Columnas cromatograficas pequeñas Adsorción selectiva 100mg/ml columna Conocer mejor los mecanismos de interacción
PURIFICACION DE ENZIMAS INDUSTRIALES Buscar propiedades únicas de nuestra enzima Centro activo Mecanismo catalítico Termo-resistencia Dominios añadidos por Ingeniería Genética Tamaño Características de la superficie (grupos ionizados)
PURIFICACION: CENTRO ACTIVO - INHIBIDORES CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD Adsorción muy selectiva de nuestro enzima sobre inhibidores inmovilizados o análogos de substratos Desorción con substratos u otros inhibidores solubles
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD Soportes mal diseñados muchos grupos, muy próximos al soporte Afinidad es casi imposible Otro tipo de adsorciones… Ionicas, endrofobicas…
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD OH Muy pocos grupos Alejados de la superficie del soporte por brazos espaciadores inertes Unión química al soporte no modifique la interacción enzima soporte
EVALUACION DE AFINIDAD ?? ensayo actividad producto tiempo B+C Adsorción inespecífica producto tiempo B+C Adsorción por afinidad
ADSORCION DE Guanidino benzoatasa SOBRE SOPORTES DE AFINIDAD Influence of immobilized agmatine concentration on the GB adsorption on CH–A. Purified enzyme was incubated with CH–A activated with 0, 2, 8 and 15 mol agmatine/ml gel
PURIFICACION DE Guanidino benzoatasa Purification of GB from ascitic fluid of Ehrlich tumor. SDS–PAGE analysis of the proteins from ascitic fluid of Ehrlich tumor adsorbed on CH–A. Experiments were performed as described in Experimental. Lanes: 1=molecular mass markers; 2=crude preparation of ascitic fluid of Ehrlich tumor; 3=proteins in the supernatant after adsorption on CH–A at 15 mM NaCl; 4=proteins adsorbed on CH–A at 150 mM NaCl; 5=GB desorbed in the presence of enzyme substrate (NPGB).
Activación interfacial de lipasas PURIFICACION DE ENZIMAS Activación interfacial de lipasas Forma abierta Forma cerrada Gota De substrato
PURIFICACION DE LIPASAS Adsorción interfacial sobre soportes hidrofóbicos a baja fuerza iónica Bolsillo hidrofóbico muy grande Pequeños bolsillo hidrofóbicos… Solo se absorben aFI
Absorción selectiva de lipasas CARACTERISTICAS DE ADSORCION INTERFACIAL Absorción selectiva de lipasas Aumento de actividad hacia substratos solubles pequeños Alteración de enantioselectividad Desorcion con detergentes o codisolventes
PURIFICACION DE LIPASAS POR ADSORCION SELECTIVA Mw ( kDa ) 30 45 66 94 20.1 1 5 2 3 4 a b Figure 1 SDS-PAGE. Line 1.- Low molecular weight marks. Line 2.- Commercial preparation of BTL2. Line 3.- BTL2 adsorbed on octyl-agarose. Line 4. octyl-aragose preparation after desorption with 0.2% triton Line 5. Supernatant after the adsorption with 0.2% triton. The protein concentration was 2.5 mg/mL in each case, except in the supernatant that was concentrated around 10 times with centricon. b) Native electrophoresis. Line 1 Crude extract of BTL2. Line 2.- Purified lipase. Experiments were performed as described in the experimental section.
PURIFICACION DE ENZIMAS MODIFICADAS POR INGENIERIA GENETICA
Cu+2 ENZIMAS CON COLAS DE HISTIDINA His Modificación muy pequeña (actividad, estabilidad…) Desorcion en presencia de imidazol Formula del imidazol rober…..
PURIFICACION DE ENZIMAS CON COLAS DE HISTIDINA Problema las proteínas nativas también se adsorben a quelatos por unión multipuntual His His Solución: soportes con muy baja densidad de quelatos adsorcion en presencia de concentraciones moderadas de imidazol
Effect of the metal chelate PURIFICACION DE ENZIMAS CON COLAS DE HISTIDINA 100 Effect of the metal chelate on the adsorption of host proteins and poly-His GA
100 Adsorption of host proteins and tagged GA on PURIFICACION DE ENZIMAS CON COLAS DE HISTIDINA 100 Adsorption of host proteins and tagged GA on different IDA-Cu supports in the presence of imidazole 7 mM;
Effect of the length of spacer arms on adsorption of NATURAL proteins PURIFICACION DE ENZIMAS CON COLAS DE HISTIDINA Effect of the length of spacer arms on adsorption of NATURAL proteins
PURIFICACION DE ENZIMAS CON COLAS DE HISTIDINA Over-expression of poly-His GA in E. coli. Proteins were analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and visualized with Coomassie blue. Lanes 1=molecular mass markers; 2=crude extract of E. coli TG1 (pGH6); 3=crude extract of a control culture of E. coli TG1 (pBCKS+); 4=purified poly-His GA following the optimum procedure. Arrows indicate the location of the - and -subunits of poly-His GA.
Adsorcion iónica multipuntual PURIFICACION DE ENZIMAS POR INTERCAMBIO IONICO - - - - - - - + + + + Adsorcion iónica multipuntual Desorcion selectiva a concentraciones crecientes de NaCl
Regiones “planas” ricas en campos negativos Distintas proteínas SOPORTES DE INTERCAMBIO CONVENCIONAL - + + - + + - + + - + + + + + Regiones “planas” ricas en campos negativos Distintas proteínas Distinta fuerza iónica
+ + + Soportes poco activados Adsorcion selectiva de proteínas grandes - - + - - + - - Soportes poco activados Adsorcion selectiva de proteínas grandes
- - - - - - - - - - - - - -
ENZIMAS DE TERMOFILOS GRANDES EXPRESADAS EN ORGANISMOS MESOFILOS Mayor resistencia al calor Absorción selectiva sobre soportes muy poco activados
Purificacion de proteinas grandes de termofilo clonadas en emsofilos Gel filtration analysis of E. coli extracts The crude extract was submitted to 70ºC for 20 min. This sample was injected in a glass column containing 100 ml of 4BCL agarose. Flow rate was 0.5 ml/min. (—) Crude extract before thermal precipitation. () Crude extract after thermal precipitation.
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + Purificacion de proteinas grandes de termofilo clonadas en mesofilos - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Conventional supports: Large and small proteins may have adsorption Poorly activated supports: Only large proteins may have adsorption
Purificacion de proteinas grandes de termofilo expresadas en mesofilos b-galactosidase MW (kDa) 94 67 43 31 1 2 3 4 5 6 7 Analysis by SDS-PAGE of proteins adsorbed/desorbed on different aminated supports. Lane 1: Molecular marker, Lane 2: Crude extract of beta-galactosidase from Thermus sp. strain T2. expressed in E. coli. Lane 3: Proteins adsorbed on 1 µmol aminated agarose support, Lane 4: Proteins adsorbed on 2.5 µmol aminated agarose support, Lane 5: Proteins adsorbed on 5 µmol aminated agarose supports, Lane 6: Proteins adsorbed on 10 µmol aminated agarose support, Lane 7: Proteins adsorbed on 40 µmol aminated agarose support. Experiments were performed as described in Methods.