2Instituto de Fisiología Celular UNAM. *Tutor principal Un péptido de virus de insecto produce una fuerte respuesta humoral comparable con la respuesta producida con adyuvantes Jesús Zepeda Cervantes1, 2, Rosalba Carreón Nápoles1, José Iván Sánchez Betancourt1, Luis Vaca Domínguez2, Alicia Sampieri García2*. 1Programa de Maestría en Ciencias de la Producción y Salud Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia UNAM, 2Instituto de Fisiología Celular UNAM. *Tutor principal RESULTADOS INTRODUCCIÓN Las vacunas tradicionales se basan en virus atenuados o inactivados. Sin embargo, estas vacunas presentan ciertos inconvenientes como inactivación incompleta en virus inactivados, o reversión a estado virulento en los virus atenuados1. Las vacunas recombinantes como las vacunas de subunidades no presentan estos inconvenientes y son alternativas a las vacunas clásicas. A pesar de esto, las vacunas recombinantes también presentan algunas desventajas, como la necesidad de aplicar concentraciones más elevadas de antígeno para tener el mismo efecto protector que una vacuna de virus atenuado o inactivado, lo que puede hacerlas más costosas, eso tiene impacto en la salud humana pero principalmente veterinaria2. Es por eso que es importante la búsqueda y desarrollo de nuevos adyuvantes. El objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad adyuvante de un péptido de 110 aminoácidos de poliedrina (proteína de baculovirus) por medio de un ELISA indirecto utilizando la proteína verde fluorescente (GFP) como antígeno en un modelo murino. PAGE-SDS A B 4 Fig. 4A. PAGE-SDS. 1) PH110-GFP (40.9 kDa); 2) GFPr E. coli (28 kDa); M) marcador; y 3) GFP soluble baculovirus 27.1 kDa. Las proteínas muestran una relativa pureza así como el tamaño esperado. El western blot mostró la presencia de GFP (B) en la GFPs de baculovirus (27.1kDa) (1) y en la PH110GFP (40.9 kDa) (2). MATERIALES Y MÉTODOS Células, virus y proteínas: Las células SF-9 (1X106) se infectaron con un baculovirus recombinante que expresa GFP fusionada a un péptido de poliedrina de 110 aa (PH110GFP). De la misma forma se produjo GFP soluble (GFPs) utilizando otro baculovirus recombinante. Se utilizó un baculovirus sin modificaciones para producir poliedras. (Fig. 1). A los 3 días PI las células se sonicaron y las partículas se purificaron por 3 rondas de centrifugación-lavado con PBS y se observaron por microscopía electrónica de barrido (SEM) y de transmisión (TEM) (Fig. 2 y 3). Modelo murino: Se utilizaron 5 grupos de 4 ratones hembras BALB/c de 6 semanas de edad por grupo: 1) PBS; 2) GFP sin adyuvantes (SA); 3) GFP con Adyuvante Completo (ACF) e incompleto de Freund (AIF); 4) PH110GFP SA; y 5) PHGFP con ACF y AIF. La inmunización se llevó a cabo con 2 aplicaciones de 10 µg de GFP cada una, con un intervalo de 2 semanas. PAGE-SDS y Western blot: Para conocer el peso molecular de cada proteína se llevó a cabo una electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (PAGE) y se tiñó con azul de Coomassie. La otra parte del gel se transfirió a una membrana de nitrocelulosa, y se bloqueó con leche al 5% y se incubó con un anticuerpo comercial anti-GFP 1:5,000 de conejo y con un anti-conejo conjugado a HRP. La membrana se lavó después de cada incubación y se revelo con Super Signal West Femto, se expuso en una película kodak. ELISA indirecta: Se utilizaron placas de poliestireno de 96 pozos sensibilizadas con 50 µl de GFPr de E. coli (1µg/ml) incubándolas 2 hrs a 37°C. Se lavó 3 veces con PBST (PBS y tritón al 0.2%) y se bloqueó con leche libre de grasa al 2% en PBS durante 1 hr a 37°C. Después de 3 lavados, se colocaron 50 µl de los sueros de los ratones a una dilución 1:50 durante 1hr a 37°C. La placa se lavó 5 veces y se colocaron 50 µl de anticuerpo secundario anti-ratón de una dilución de 1:5000 durante 1hr a 37°C. Se lavó 5 veces y se colocaron 50 µl de TMB durante 20 minutos a temperatura ambiente. Finalmente se colocaron 50 µl de ácido sulfúrico 0.16M como solución de paro y se realizó la lectura utilizando un espectrofotómetro con un filtro de 490 nm. Fig. 5. Evaluación del efecto adyuvante de las pseudopoliedras. No hay diferencia estadística entre PH110GFP con o sin adyuvante y GFP soluble con adyuvante. La GFPs no induce una respuesta significativa de anticuerpos Discusión y conclusiones: La TEM señaló que la pseudopoliedra no contiene virus y que difiere en cuanto a tamaño y morfología con respecto a la poliedra WT. Sin embargo la PCR mostró la presencia de DNA viral (datos no mostrados). Existen pocas investigaciones sobre el uso de péptidos como adyuvantes. Rudra et al. (2009) reportaron una fuerte respuesta humoral en ratones al aplicar un péptido de ovoalbúmina fusionada a un péptido (Q11) que forma nanofibras sin el uso de adyuvantes. En este caso, el péptido de 110 aa de poliedrina forma estructuras en forma de poliedra, lo que permite también una fácil purificación. La aplicación de GFPs logró producir respuesta humoral significativa y de larga duración solo cuando se co-administró con adyuvantes. Esta respuesta inmune fue similar a la inmunización con PH110GFP, demostrando la capacidad adyuvante del péptido. En contraste, la purificación fácil y sin el uso de columnas especiales y costosas, así como su efecto adyuvante hace a este sistema de expresión un candidato para ser usado como un vehículo de expresión de antígenos para la elaboración de vacunas recombinantes. PERSPECTIVAS: la fusión de este péptido de poliedrina a péptidos de interés inmunológico como proteínas o péptidos virales de producción de vacunas a gran escala, pues resulta económica y segura. 2 A 3 A B B Bibliografía: 1 Akagi, T.; Baba, M.; Akashi, M. 2012. Adjuvants and delivery systems: regulation of immune responses by nanoparticle-based vaccine. Adv Polym Sci 247: 31–64 2 Arnon, R. and Ben-Yedidia, T. 2003. Old and new vaccine approaches. International Immunopharmacology 3 1195 – 1204. 2 Noad, R. and Roy, P. 2003. Virus-like particles as immunogens. TRENDS in Microbiology. 11 (9). 438 – 444. Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) polyhedra mutant. Virus Research. 140 (2009) 1–7. 3 Rudra, J. S.; Mishra, S.; Chong, A. S.; Mitchell, R. A.; Nardin, E. H.; Nussenzweig, V.; Collier, J. H. 2012. Self-assembled peptide nanofibers raising durable antibody responses against a malaria epitope. Biomaterials 33: 6476 – 6484. 1 2 3 Fig. 1. Promotor de poliedrina (rojo) utilizado para la expresión de: poliedrina completa de 245 aa (azul) (A); GFP (verde) fusionada a un péptido de 110 aa de poliedrina (azul) (B); o GFP soluble (verde) (C). Fig. 2. La poliedrina silvestre (WT) forma cristales de proteína (poliedras). La SEM muestra estructuras regulares de 1 a 2 µ. La TEM muestra baculovirus ocluidos en la poliedra (TEM). Fig. 3. Estructuras tipo poliedra (Pseudopoliedras). La SEM mostró que estas estructuras tienen un tamaño similar al de las poliedras miden de 1 a 2 µ pero tienen una forma mas irregular. La TEM no mostró evidencia de baculovirus dentro de las pseudopoliedras.