Laboratorio de Biología Molecular e Histocompatibilidad Utilidad de técnicas moleculares en el monitoreo de infecciones en el trasplante: Validación de la Carga viral CMV con el estándar Internacional Bioq. Ariel Sánchez Laboratorio de Biología Molecular e Histocompatibilidad 20 min

Patógenos virales en pacientes transplantados Herpes Simplex Varicella Zoster Epstein-Barr virus Citomegalovirus HHV-6 HHV-7 HHV-8/KSHV Polyomavirus BK/JC Parvovirus B19 Papilomavirus Adenovirus, RSV, Influenza, parainfluenza. Virus de la hepatitis B y C

Causas Inmunosupresión postransplante. Exposición a la comunidad (Influenza, adenovirus). Transmisión por injerto (CMV, EBV, etc.). Reactivación Infecciones simultaneas múltiples ( Ej.: CMV y HHV6).

CMV Técnicas Cultivo (convencional y shell vial assay) Medición del antígeno pp65 Moleculares: PCR (cualitativa, cuantitativa), NASBA

Reacción en cadena de la polimerasa

PCR en tiempo real cuantitativa Altas concentraciones Bajas concentraciones Threshold

Cuantificación absoluta Muestra desconocida con concentracion extrapolada desde curva 5,000 50,000 500,000 5,000,000 50,000,000 CT 500,000,000 Copias

3 c/ml 1.000 c/ml 10 c/ml 10.000 c/ml 3 c/ml American journal of transplantation 2009; 9: 258-268

American journal of transplantation 2009; 9: 258-268

Variables en la técnica Muestra a estudiar (plasma o sangre entera) Protocolo de extracción de ácidos nucleicos. Fragmento del genoma y reactivos a utilizar en la PCR Termociclador Unidades en que se informa el resultado (C/ml, mEq/ul, Part virales/ml, etc)

Estandares de CMV y EBV (WHO) CMV (Año 2010): Desde cepa Merlin con valor de 5x106 UI/ml. EBV (Año 2011): Desde cepa B95-8 (tipo I) con valor de 5x106 UI/ml. CMV: participaron 32 laboratorios de 14 países.

Factor de conversión promedio: 1,145 Diferencia promedio: 0,06 log

EBV 5.10e5 /1,37.10e6 = 0,365 Rango lineal: 182 -3.650.000 UI/ml

Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Logaritmo CV-EBV(Argene)- Plataforma Rotor-Gene

12 laborarios franceses Semenova T; Lupo J; Alain S; et al. Multicenter evaluation of whole-blood Epstein –Barr viral load standarization using the WHO international standard. JCM , 2016 vol 54 (7) 1746-50

Conclusión La utilización de calibradores consenso en estas técnicas, incentiva el desarrollo de estudios multicéntricos con resultados estandarizados, promoviendo de esa manera un mejor manejo clínico del paciente.

Consideraciones Plasma y sangre entera son muestras válidas para PCR cuantitativa (preferencia: plasma+EDTA) PCR cualitativa, en distintas muestras ( BAL, LCR, BX, etc) Cambios de al menos 0.5 log UI/ml representan cambios significativos en la replicación. Variabilidad, es mayor en cargas virales bajas, considerar significancia en cambios de mas de 0.7 log UI/ml.