PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA (MÁXIMO CINCO REFERENCIAS) ANÁLISIS FUNCIONAL DEL OPERÓN virD4 DEL PLÁSMIDO pUM505 DE Pseudomonas aeruginosa (ARIAL 72) Eliseo Silva Espino, Facultad de Químico Farmacobiología (UMSNH). enfriafarma@hotmail.com. Asesora Dra. Martha Isela Ramírez Díaz, Instituto de Investigaciones Químico Biológicas (UMSNH). marthaisela_ramirez@hotmail.com. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA A B El plásmido conjugativo pUM505 que fue aislado de una cepa clínica de Pseudomonas aeruginosa de un paciente hospitalizado, posee una Isla de patogenicidad (PAI) que consiste de 78 genes (Fig. 1) de los cuales 64 han sido encontrados en las PAIs PAPI-1 y PAPI-2 de P. aeruginosa PA14 [1], un aislado clínico significativamente más virulento que la cepa de P. aeruginosa PAO1 [2]. Adicionalmente, la PAI de pUM505 posee genes homólogos a los genes virB4 y virD4 de Agrobacterium tumefaciens, que codifican a proteínas que forman parte de un sistema especializado en la transferencia de genes oncogénicos a células vegetales, resultando en la formación de tumores [3]. Los genes virB4 y virD4 no han sido reportados en genomas de P. aeruginosa, por lo que la presencia de los genes en pUM505 sugiere que estos puedan participar en la virulencia de P. aeruginosa. El grado de virulencia puede ser determinado cuantitativamente con ayuda de modelos patógeno-hospedero, como el uso del modelo con la amiba Dictyostelium discoideum [2] y el modelo en hojas de lechuga [4]. Figura 1. A) Mapa genético de pUM505. Con flecha o punta de flecha se representan los genes y su dirección de transcripción. Los colores representan la probable función de las proteínas que codifican los genes. B) Análisis de secuencia del posible operón con el gen virD4 de pUM505 y PAPI-1. En % se presenta el grado de identidad, HP corresponde a proteínas hipotéticas. METODOLOGÍA RESULTADOS ENSAYOS DE VIRULENCIA Control positivo. 4° día de incubación 6° día de incubación Modelo de Dictyostelium discoideum Pre inocular bacterias y esporas Estandarizar concentraciones Sembrar en medio sólido SM Incubar a 22°C de 7-10 días Medición de grado de fagocitosis diariamente Figura 2. Virulencia de las cepas de P. aeruginosa PAO1, PAO1-pUM505 y PA14 en modelo de D. discoideum. Modelo de lechuga A B Figura 3. A) Virulencia en hojas de lechuga inoculadas con P. aeruginosa (PAO1, PAO1-pUM505, PA14) y E. coli (Top10). B) Determinación de las UFC de las células extraídas de la lesión de la hoja. controles Positivo Negativo Problemas Hacer diluciones con MgSO₄ Inocular en hoja de lechuga Incubar a 25 °C 4 días Medir área de lesión Pre inocular bacterias Contabilizar las UFC AMPLIFICACIÓN Y CLONACIÓN DEL OPERÓN virD4 Figura 4. Amplificación por PCR del operón virD4. Carriles M, marcador de 1 kb; 1 y 2 DNA total de colonia PAO1-pUM505 Amplificar por PCR Clonación en vector pJET 1.2 Lisis alcalina Digestión con enzimas de restricción Subclonación en vector pUCP20 plac P. aeruginosa y E.coli Modelos patógeno-hospedero CONCLUSIÓN La cepa de P. aeruginosa PAO1-pUM505 muestra mayor grado de virulencia que la cepa de PAO1. Esto nos indica que pUM505 contiene genes funcionales involucrados en virulencia. (MÁXIMO CINCO REFERENCIAS) Ramírez-Díaz y col., 2011. Plasmid 66: 7-18. Carilla-Latorre y col., 2008. BMC Microbiol. 8:109. Zechner y col., 2012. Phil. Trans. R. Soc. B. 367: 1073 -1087. Battle y col., 2008. J. Bacteriol. 190: 7130-7140. AGRADECIMIENTOS Agradezco a la Dra. Martha Isela Ramírez-Díaz, profesor investigador del IIQB de la UMSNH y al QFB Ernesto Rodríguez Andrade por las sugerencias que han dado realce al presente trabajo. Este trabajo forma parte del proyecto de investigación 2.35, financiado por la Coordinación de la Investigación Científica de la UMSNH.