Determinación del estado funcional de la barrera sangre-LCR y de la síntesis de inmunoglobulinas en el SNC mediante modificaciones a técnicas de CPM Scientifica. DrC. Sergio González García MSc Marisol Peña Sánchez DrC. Alina González-Quevedo Monteagudo Departamento de Genética y Neurobiología Instituto de Neurología y Neurocirugía

El término “Barrera hematoencefálica” describe una serie de mecanismos que controlan el medio interno del cerebro. Su integridad es esencial para el desarrollo y funcionamiento normal del cerebro. Funciones de la BHE Protege al cerebro de ¨sustancias exógenas y endógenas” de la sangre que lo pueden dañar. Provee al cerebro los nutrientes esenciales y elimina los productos de desecho. Restringe los movimientos de los iones y fluidos (producción de líquido intersticial con las condiciones requeridas para el funcionamiento neuronal). Mantiene la homeostasis del tejido cerebral

Líquido cefalorraquídeo (LCR) Se encuentra dentro de los ventrículos y espacios subaracnoideos (cisternal, cortical y lumbar) FORMACIÓN REABSORCIÓN Funciones del LCR: Mantener un ambiente externo constante para las neuronas y gliales. Amortiguador de glopes y traumas al encéfalo. Mantener la circulación de sustancias específicas y neuropéptidos. Nutrición, transporte y eliminación de sustancias.

PASO DE PROTEÍNAS AL LCR PROCEDENCIA DE LAS PROTEÍNAS DEL LCR PLASMÁTICAS --------- 75 - 80% DERIVADAS DEL SN ---- 20 – 25% PASO DE PROTEÍNAS AL LCR El paso de proteínas de la sangre al LCR es por difusión pasiva. Todas las proteínas de la sangre difunden de la misma manera al LCR, pero a diferentes velocidades. El gradiente de concentración depende del peso molecular. La concentración de proteínas en el LCR depende de: Concentración en sangre Velocidad de flujo del LCR

Elevación de la [proteínas] en el LCR Por paso de proteínas del plasma al LCR: Incremento de [proteínas] plasmáticas Disfunción de la barrera sangre-LCR Por incremento de síntesis proteínas por el cerebro (síntesis intratecal). Enfermedades que cursan con aumento de [proteínas] en el LCR Síndrome Guillain Barre. Polineuropatía crónica inflamatoria desmielinizante (CIDP) Otras Polineuropatías (diabética, neuropatía epidémica cubana) Tumores. Esclerosis Múltiple Neuromielitis óptica Ictus

TECNICAS PARA EVALUAR EL ESTADO FUNCIONAL DE LA BARRERA SANGRE-LCR Y LA SÍNTESIS DE INMUNOGLOBULINAS EN EL SNC RMN con gadolinium Focalización isoeléctrica Electroforesis en agarosa HR y PAGE-LCR Proteínas específicas de SNC (S100B). Cuantificación de Q albúmina Cuantificación del Indice IgG. El proteoma del suero es diferente al del LCR y existen proteínas que son específicas solo del SNC y pueden ser empleadas como marcadores.

Concentración de diferentes fracciones de proteínas (mg/L) en LCR y plasma. Proteínas LCR Plasma LCR/Plasma Prot. totales 350 70,000 0.005 Albúmina 155 36,600 0.004 Transferrina 14.4 2,040 0.007 IgG 12.3 9,870 0.001 IgA 1.3 1,750 IgM 0.6 700 Conteo de células Concentración de proteinas Estudio citológico Estudio microbiológico Análisis de Bandas Oligoclonales Estudio inmunológico Otros estudios: neurotransmisores Indicación de Punción Lumbar

QAlb= [Alb]LCR/[Alb]suero ESTADO FUNCIONAL DE LA BARRERA SANGRE-LCR La albúmina no es sintetizada en el SNC Toda la albúmina del LCR viene de la sangre MEDIDA CUANTITATIVA Cociente albúmina QAlb= [Alb]LCR/[Alb]suero Qalb dependiente de la edad 9.0 - 14,3 daño ligero de BS-LCR 14,4 - 33,3 daño moderado de BS-LCR 33,4 – 100 daño marcado de BS-LCR >100 rompimiento total de la BS-LCR MEDIDA CUALITATIVA DBSL-PAGE LCR Proteínas elevadas. Fracción β-2 disminuida Prealbúmina-1 disminuida

Síntesis intratecal de IgG Medidas cuantitativas: Fórmulas lineales: Relación IgGLCR/IgGs; Indice IgG Fórmulas no lineales: Tourtellotte, Reiber, Ohman Velocidad de síntesis de IgG Índice IgG = QIgG/QAlb Medidas cualitativas: Síntesis intratecal de inmunoglobulinas de heterogeneidad restringida Electroforesis comparativa de las proteínas del LCR y suero (agarosa, poliacrilamida) Focalización isoeléctrica del LCR y suero con inmunoblotting para IgG Bandas oligoclonales específicas al LCR ~ 60% de los pacientes Bandas oligoclonales específicas al LCR ~ 95% de los pacientes 9 9

Cuantificación de albúmina en suero y LCR por una técnica modificada Modificación de la técnica de UMELISA MICROALBÚMINA ELISA heterogéneo tipo sándwich que utiliza como fase sólida tiras de ultramicroELISA, revestidas con anticuerpos monoclonales contra la albúmina humana. Diluciones específicas de las muestras de suero y LCR para adecuar la relación Ag-Ab 10 µL de estándares, controles y muestras diluidas incubar por 30 min a 25°C en cámara húmeda Lavado y secado 10 µL del conjugado 10 µL del sustrato diluido 1:10 en el tampón sustrato Lectura de la intensidad de la fluorescencia

ESTUDIO DE REPETIBILIDAD n=15 ESTUDIO DE REPRODUCIBILIDAD LCR-1 LCR-2 Suero-1 Suero-2 Media 21.93 18.36 51.39 42.98 SD 1.31 1.72 4.64 4.80 CV 5.98 9.34 9.03 11.11 [Proteína LCR-1]= 51.8 mg/dL [Proteína LCR-2]= 39.0 mg/dL LCR y suero alicuotados y congelados por 12 días (-20oC). ESTUDIO DE REPRODUCIBILIDAD CV 1 2 3 4 5 6 7 8 9 LCR-1 6.0 10.7 6.2 6.1 3.0 7.0 3.1 7.7 LCR-2 9.3 7.8 6.4 9.2 4.3 8.3 9.1 4.4 4.7 Suero-1 9.0 8.5 11.1 10.5 9.9 7.1 7.2 10.3 12.7 Suero-2 8.8 3.2 12.1 10.4 11.4 8.9 10.1 R curva 0.992 0.998 0.993 0.997 0.995

Cuantificación de albúmina en suero y LCR por una técnica modificada Kit de microalbuminuria de CPMscientifica Curva de calibración Concentración DO 0,735 2,95 0,933 5,9 1,152 11,8 1,399 23,6 1,739 y=0,0913 + 0,0413*x; r = 0,9784; p = 0,0038 Modificaciones a realizar Muestras de LCR No PT (mg/dL) ΔDO Concentración Albúmina Media 1 36.7 1.300 12.11 12.71 1.459 16.29 1.263 11.13 1.270 11.32 2 41.0 1.568 19.60 17.63 1.435 15.66 Diluir muestras de LCR y suero. Modificar volúmenes de reacción. Ajustes del tiempo de incubación y/o temperatura.

Cuantificación de IgG en suero y LCR por una técnica modificada Modificación del método turbidimétrico firma CPMScientifica Tecnologie Biomediche que cuantifica la IgG en suero mediante una reacción antígeno-anticuerpo. IgG en suero Ajustes en los volúmenes de reacción: Modificaciones en los volúmenes a aplicar de muestras, calibradores y controles y adecuarlos a un volumen final menor de 350 µL para montar la técnica en placas de ELISA. Mantener la relación adecuada entre los reactivos empleados. IgG en LCR Ajustes en los volúmenes y condiciones de reacción: Modificaciones en los volúmenes a aplicar de muestras, calibradores y controles. Mantener la relación adecuada entre los reactivos empleados. Modificar el tiempo y la temperatura de incubación

Cuantificación de IgG en suero y LCR por una técnica modificada Curva DO Conc A 0,042 0,75 B 0,068 1,5 C 0,108 2 D 0,132 3 E 0,238 6 C-1 0,062 1,14 C-2 0,126 2,88 Curva DO Conc A 0,155 1,65 B 0,278 3,29 C 0,469 6,58 D 0,751 13,16 E   26,32 C-1 0,502 7,92

Proteínas totales (mg/dL) Descripción de los parámetros cuantitativos evaluados en LCR y suero a partir de modificaciones a técnicas comerciales. Parámetros Mediana (10-90th) Valores de referencia Proteínas totales (mg/dL) 55,7 (36,2-109,8) 22,3 - 50,2 Albúmina LCR (mg/dL) 27,7 (14,7-44,8) 10,0 - 30,0 Suero (g/L) 37,8 (29,2-45,6) 35 – 55 IgG 3,5 (1,3-9,9) hasta 3 10,0 (6,27-14,4) 6,8 - 14,4 UMELISA microalbúmina IgG suero CPMScientifica Pacientes n=61

Comparación del estudio inmunológico de LCR mediante técnicas modificadas respecto a las técnicas validadas Parámetros Técnicas modificadas Técnicas validadas Z p UMELISA microalbúmina IgG suero CPMScientifica Reactif Albumine IgG Kit IMMAGE Alb LCR (mg/dL) 22,35 (7,8-44,78) 18,2 (8,8-57,2) 0,038 0,9699 Alb Suero (g/L) 37,47 (28,2-41,8) 37,45 (33,2-45,6) 0,132 0,8951 QAlb 6,51 (1,93-12,04) 4,77 (2,23-16,24) 0,113 0,9099 IgG LCR (mg/dL) 2,62 (1,06-10,24) 2,855 (1,43-15,7) -0,697 0,4857 IgG Suero (g/L) 9,68 (6,71-14,17) 11,9 (7,8-18,7) -2,035 0,0418 Q IgG 2,78 (1,03-12,18) 2,54 (1,19-14,3) -0,057 0,9549 Índice IgG 0,49 (0,34-0,6) 0,49 (0,43-0,63) -0,791 0,4287 Prueba no paramétrica Mann-Whitney; p<0,05 Pacientes n=16

Kits CPMScientifica IgG suero por método turbidimétrico Microalbuminuria en orina por método turbidimétrico En principio realizar modificaciones basadas en: Diluciones de muestras y cambios en volumen de reacción. Tiempo y temperatura de incubación. También se pudiera en un futuro: Modificación en la concentración del anticuerpo inmovilizado a partículas látex en función de las concentraciones de IgG y albúmina en LCR y suero para lograr una mejor relación antígeno-anticuerpo. Además: Sería oportuno poder estimar la síntesis a nivel de SNC de IgM e IgA, aunque hay que considerar que los niveles de estas inmunoglobulinas en LCR son inferiores, (10 veces menos que IgG)

CONCLUSIONES Muchas Gracias Estos resultados preliminares del estudio del LCR, obtenidos a partir de las modificaciones de técnicas comerciales, diseñadas para otros fluidos biológicos, son útiles para estimar la funcionalidad de la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo y la síntesis intratecal de inmunoglobulinas. COLABORADORES Lic. Mélany Betancourt Loza MSc. Anay Cordero Eiriz Téc. Mirelys Peña Nolasco Lic. Isabel Fernández Almiral DrC. María Caridad Menéndez MSc. Rebeca Fernández Carriera AGRADECIMIENTOS MSc. Yamilia Garriga CPMScientifica DrC. Lourdes Lorigados CIREN Muchas Gracias