I-Alteraciones Estructurales Química Biológica Patológica HEMOGLOBINOPATIAS I-Alteraciones Estructurales 2017 Tema:3 (3)  Dra. Silvia Varas svaras@unsl.edu.ar

Esquema de la Molécula de Hemoglobina

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ESTRUCTURA DE LA CADENAS DE GLOBINAS Cada subunidad esta constituida por 8 -hélices rotuladas AH conectadas por uniones polipeptídicas cortas Hys-8 Las curvas en la estructura se designan AB, CD, EF, FG, y así sucesivamente, y refleja los segmentos que conectan las distintas alfa hélice. Hys-7

UNION DEL HEM A LA GLOBINA Y AL OXÍGENO El hierro se une la Hys F8 ( histidina proximal) Al otro lado se une el O2, y puede interaccionar con la Hys E7 (histidina distal)

Esta vista muestra los dos enlaces de coordinación a Fe2+ perpendicular al sistema de anillo de porfirina. Uno de estos dos enlaces está ocupada por un residuo de His, a veces llamado el residuo His proximal. El otro enlace es el sitio de unión para el oxígeno. Los cuatro restantes son enlaces de coordinación en el plano y unidos al sistema plano del anillo de la porfirina. El hierro en el estado Fe2+ se une al oxígeno de forma reversible; en el estado Fe3+ no se une el oxígeno.

RESIDUOS EN CONTACTO CON EL HEM Los residuos no polares en los segmentos C, CD, E, F y FG protegen la abertura al impedir que el agua penetre.

BOLSILLO DEL HEM La jaula hidrofóbica donde se encuentra el hem es la fuerza estabilizadora principal para la unión del hem a la proteína El medio no polar dificulta la oxidación de Fe2+ a Fe3+.

La estructura cuaternaria de la hemoglobina presenta fuertes interacciones entre subunidades diferentes. La interfaz 11 (y su contraparte 22 ) involucra más de 30 residuos. La interacción 12 (y 21) involucra 19 residuos. Las interacciones hidrófobas predominan en las interfaces, pero también hay muchos enlaces puentes de hidrógeno y en menor medida interacción de pares de iones.

Desoxihemoglobina Oxihemoglobina La oxigenación pone a las cadenas  mas juntas

Estado Desoxihb o Tenso (T) Estado (T): hay cerca 22 contactos (12 puentes de hidrogeno) Estado Oxihb o Relajado (R) Estado R: hay cerca 40 contactos (19 puentes de hidrogeno)

Desoxigenación: Oxigenación: ------ En el tetramero, cada cadena  esta en contacto con las dos cadenas . Los dos contactos se los definen como 11 y 12 (y 21 y 22). La mayoría de los movimientos de oxigenación/deoxigenación toma lugar en las interfaces 12 (21) (17 contactos) Mientras que las fases 11 y 22 permanecen inmóviles (40 contactos) Desoxigenación: Oxigenación: ------

HEMOGLOBINOPATÍAS ALTERACIONES CUALITATIVAS ALTERACIONES CUANTITATIVAS Hemoglobinopatías estructurales, con Hb anómalas ALTERACIONES CUANTITATIVAS Síndromes Talasémicos, con disminución en la síntesis de Hb normal

Clasificación: ESTRUCTURALES Cadenas  Cadenas  Cadenas  Cadenas  Fusión de Cadenas:    TALASEMIAS - talasemia - talasemia - talasemia - talasemia - talasemia PERSISTENCIA HEREDITARIA DE HEMOGLOBINA F Con deleción Sin deleción Ligado al cluster  No Ligado al cluster 

VARIANTES ESTRUCTURALES DE HEMOGLOBINAS NOMENCLATURA - A partir de 1949 cuando se describió la anemia drepanocítica que fue designada con una letra del alfabeto (HbS), se siguieron designado con letras. - Lugar de origen - Presencia de variantes de Hb  electroforesis

Origen HbC HbS HbJ HbH E D HbM Hb Bart OArab G Lepore Hb inestable Hb con afinidad alterada por el O2

Clasificación molecular PATOLOGIA MOLECULAR: a-Sustituciones de una única base. HbS b-Variantes de cadena de hemoglobina elongadas (cadenas alargadas). Hb CS c-Cadenas de globinas truncadas (deleción de fragmentos): Hb más cortas. Hb Leiden, Gun Hill d- Hemoglobinas de fusión (hibridización anómala). Hb Lepore

Clasificación según Fenotipo I-Propiedades físico-químicas alteradas A-HbS (polimerización deoxihb S): síndromes drepanocíticos B-HbC (cristalización): anemia hemolítica, microcitosis II-Variantes de Hemoglobina Inestables A-Anemia hemolítica de cuerpos de Heinz Congénita III- Variantes con afinidad al O2 alterada A-Variantes con alta afinidad: eritrocitosis B-Variantes con baja afinidad: anemia, cianosis IV-Hemoglobina M A-Metahemoglobinemia, cianosis. V- Variantes que causan un fenotipo talasémico

Hemoglobinopatías con alteración de carga superficial Estas mutaciones se hallan próximas a la superficie de la molécula de hemoglobina (mutaciones superficiales) y, la mayoría de las veces, van acompañadas de una alteración de su carga eléctrica. Con formación de estructuras intraeritrocitarias de características paracristalinas. Su manifestación clínica mas característica es la anemia hemolítica, y un ejemplo de este tipo de hemoglobinopatías son la HbS y HbC. Hemoglobinopatias inestables Son mutaciones internas que desestabilizan la molécula de hemoglobina facilitando su desnaturalización in vivo y la formación de precipitados intraeritrocitarios o cuerpos de Heinz. Se conocen con el nombre de hemoglobinas inestables, y su manifestación clínica es una anemia hemolítica crónica

Hemoglobinopatias con afinidad alterada por el oxigeno Cambios conformacionales que acompañan al proceso de fijacion reversible del oxigeno molecular. Hay dos tipos: hemoglobinopatias con aumento de la afinidad por el oxigeno, que dificultan la liberación del oxigeno (eritrocitosis) o hemoglobinopatías con disminución de la afinidad por el oxigeno, que fijan poco oxigeno, pero lo liberan muy rápidamente hacia las células. En el primer caso, existe siempre una respuesta del organismo a la hipoxia de los tejidos, con aumento de la eritropoyesis y de los eritrocitos circulantes (anemia). Metahemoglobinemias La mutación estabiliza de forma permanente el hierro de los grupos hemo implicados en estado oxidado, impidiendo la fijación reversible del oxigeno molecular.

a-Sustituciones de una única base. b-Variantes de cadena de Hb alargadas.

Mutantes de Terminación: Cadenas Alargadas Los mutantes de terminación son todos variantes de la cadena alfa globina donde hay una única sustitución de base en el codón stop UAA .

Hb Constant Spring. 1 y 2 Adulto Normal; 3 y 4 heterocigota para HbCS y º-talasemia con HbH;5:Adulto Normal; y 6 componente heterocigota para º-talasemia y HbCS

Fenotipos Clínicos y Genotipos de -talasemias

c-Cadenas de globinas truncadas En este caso, un o más aminoácidos adyacentes se pierden, pero se conserva el resto de la cadena normal. Estas variantes involucran la deleción de 1 o más codones intactos, no afectando el marco de lectura de la proteína restante. Consisten en una perdida de uno o varios nucleótidos en la secuencia del DNA que codifica la síntesis de una cadena de globina. Son ejemplos de deleciones  las Hb Freiburg (deleción de un aminoácido), Hb Lyon (deleción de dos aminoácidos) y Hb GunHill (deleción de cinco aminoácidos).

d- Hemoglobinas de fusión Hemoglobina Lepore Hemoglobina Kenya -El gen híbrido δβ se llama Lepore y - El gen híbrido βδ se llama anti-Lepore Hb Lepore tiene los primeros 20 a 80 aminoácidos de las cadenas  y los últimos 50 a 100 aminoácidos del extremo C-terminal de la cadena .

Clasificación según Fenotipo I-Propiedades físico-químicas alteradas A-HbS (polimerización deoxihb S): síndromes drepanocíticos B-HbC (cristalización): anemia hemolítica, microcitosis II-Variantes de Hemoglobina Inestables A-Anemia hemolítica de cuerpos de Heinz Congénita III- Variantes con afinidad al O2 alterada A-Variantes con alta afinidad: eritrocitosis B-Variantes con baja afinidad: anemia, cianosis IV-Hemoglobina M  A-Metahemoglobinemia, cianosis. V- Variantes que causan un fenotipo talasémico

I-Hemoglobina con Propiedades Fco-Qco Alteradas Hemoglobina S Hemoglobina C Hemoglobina E Hemoglobina D

Anemia Falciforme, Drepanocítica, en Forma de Hoz (sickle), o HbS 6 Cadena 

Recién Nacidos con Anemia drepanocítica en año 2015

GAGGTG WT: Ac.Glutámico

GAGGTG S: Valina

Fisiopatología: POLIMERIZACION DE HEMOGLOBINA La presencia de HbS, permite a esta polimerizar cuando se desoxigena (Estado T), ya que la valina (pero NO Ac.Glutámico) puede unirse a ésteres complementarios en cadenas de globina adyacentes

1 2 La valina (2) se une a un bolsillo hidrófobo sobre la subunidad 1 de una molécula vecina de oxihemoglobina.

a b c c/polímero= 14 haces longitudinales= cuerpo tactoide Filamento externo  Filamento interno  b Estructura cilíndrica, insoluble y rígida c Filamento externo+ Filamento interno= 1 Haz  14 haces= 1 fibra Micrografía electrónica de fibras teñidas negativamente de HbS y la estructura deducida por reconstrucción de la imagen tridimensional. Las fibras reconstruidas esta presente como modelos de balones, (cada balón representa un tetrámero de HbS). Los modelos se presentan como la cubierta exterior (a), el núcleo interno (b) y una combinación de ambos filamentos el externo y el interno (c)

Cuerpo tectoide rompe citoesqueletoentra Ca2+ activa canal Gardos  sale K+ H2O Fibras de desoxihemoglobina S

Fisiopatología: Pasos POLIMERIZACION DE HEMOGLOBINA DESHIDRATACION CELULAR DAÑO MEMBRANA: HEMOLISIS CONSUMO DEL NO Y DISFUNCIÓN DE ENDOTELIO ADHESIVIDAD CELULAR ANORMAL INFLAMACION ISQUEMIA-REPERFUSIÓN LA ACTIVACIÓN DEL SISTEMA DE COAGULACIÓN VASCULOPATIA CRONICA

7º 2º 1º 4º 5º 3º 6º VCAM (vascular cell adhesion molecule )

Scavengers de Hb: Haptoglobina, CD163 y Hemopexina Los complejos haptoglobina- hemoglobina se une a CD 163 sobre la superficie de macrófagos/monocitos que inicia la endocitosis y degradación del complejo. Hemoglobina oxidada también libera hem férrico , este es unido a la hemopexina y degradada por los hepatocitos en el hígado. La hemólisis excesiva satura y disminuye estos sistemas

SCAVENGING o BARRIDO DE OXIDO NITRICO (NO) Hb libre en circulación MetaHb Como se produce el consumo de óxido nitrico (NO)?

 Óxido Nitrico (NO) Hay una menor activación de la Guanilato Ciclasa una enzima requerida para la generación de GMPc.  de los niveles GMPc puede marcar una activación y agregación de las plaquetas que promueve la formación del coagulo.  de los niveles GMPc tono muscular liso  vasocontricción local

HEMOLISIS INTRAVASCULAR SCAVENGING de NO Y DISFUNCIÓN DE ENDOTELIO HEMOLISIS INTRAVASCULAR

Diagnóstico Anemia con HbS:

Características clínicas 1. Fase estacionaria. Corresponde, generalmente, a los primeros años de vida (1-4 años), y sus manifestaciones clínicas son las propias de un síndrome hemolítico crónico moderado o intenso (anemia, palidez cutáneo-mucosa, subictericia conjuntival y retraso del crecimiento óseo y gonadal). 2. Fase de expresividad aguda. Se inicia a partir de los 4 años de edad, con agravamiento del cuadro anémico (Hb < 80 g/L) y aparición de diversas manifestaciones clínicas de carácter agudo debidas a las crisis vasooclusivas que afectan de forma importante a diversos órganos, aunque muy especialmente al pulmón, al riñón y al tejido óseo (drepanocitosis). Las crisis vasooclusivas constituyen, de hecho, la manifestación clínica más característica y grave de la anemia falciforme y, muchas veces, el primer síntoma. Se trata de ataques, muy dolorosos y pasajeros, que pueden durar días o semanas. 3. Fase de expresividad crónica. Es propia de los pacientes que han logrado sobrevivir la primera infancia, por lo que es característica de la adolescencia y la edad adulta. El carácter evolutivo crónico de la anemia falciforme afecta de forma importante al crecimiento y desarrollo corporal, al sistema nervioso central, cardiovascular, pulmonar, hepatobiliar y gastrointestinal. Asimismo, condiciona lesiones graves de la función renal y trastornos visuales que pueden conducir a la ceguera

Otras variantes estructurales de Hb Hemoglobina C: fue la segunda variante a ser identificada electroforeticamente. Resulta de la sustitución de Lisina por Ac.Glutámico en la posición 6 de la cadena de  de globina. Existe un número de observaciones que sugieren que la Hemoglobina C es menos soluble que la Hemoglobina A y tiene tendencia a cristalizar en el eritrocito. Hemoglobina D: este termino se usa par describir un numero de variantes de hemoglobinas que tienen una velocidad de migración idéntica a HbS en una electroforesis a pH alcalino. La mas común de estas hemoglobinas es la Hb DLOS ANGELES, sus eritrocitos son normales excepto por el elevado numero de células target. Hemoglobina E: Es la variante más común en el mundo. Resulta de la sustitución de Acido Glutámico por Lisina en la posición 26 en la cadena  de globina.

Frotis de sangre. Enfermedad Hb SS con sickle- cells. Microscopia contraste de fase. Note 3 sickled cells con proyecciones (formación tactoide). Frotis de sangre. Enfermedad Hb SS con sickle- cells. Frotis de sangre de enfermedad con Hb CC. Numerosas target cells y una población de microesferocitos (hipercromática).De las células no esferociticas, virtualmete todas son target cells. Frotis de sangre de Enfermedad Hb SC. Note  frecuencia de target cells, característica de Hb C y las células son pequeñas y densas, irregular, refleja su contenido de Hb S.

FS de enfermedad Hb EE. Hipocromia, anisocitosis y target cells. FS de enfermedad con Hb C postesplenectomia. Note las inclusiones semejantes a una barra en dos células como resultado de cristalización de Hb C. Estas células son virtualmente removidas en pac. con bazo. Enfermedad de Hb CC postesplenectomia. Microscopia de contraste de Fase. Note la barra cristalina de Hb C in una célula. FS de enfermedad Hb DD. Note target cells en una población de esferocitas pequeños, poikilocitos, y pequeños fragmentos de GR. FS de enfermedad Hb EE. Hipocromia, anisocitosis y target cells.

Clasificación según Fenotipo I-Propiedades físico-químicas alteradas A-HbS (polimerización deoxiHb S): síndromes drepanocíticos B-HbC (cristalización): anemia hemolítica, microcitosis II-Variantes de Hemoglobina Inestables A-Anemia hemolítica de cuerpos de Heinz Congénita III- Variantes con afinidad al O2 alterada A-Variantes con alta afinidad: eritrocitosis B-Variantes con baja afinidad: anemia, cianosis IV-Hemoglobina M A-Metahemoglobinemia, cianosis. V- Variantes que causan un fenotipo talasémico

II-Desordenes de Hemoglobinas Inestables Anemia Hemolítica de Cuerpos de Heinz Congénitos, (CHBA) (Congenital Heinz body hemolitic anemia) Tipo 1: Sustituciones en la vecindad del bolsillo del hem . La unión del hem a la globina involucra interacciones específicas con residuos de aminoácido no polares en las regiones CD, E, F, y FG

Desordenes de Hemoglobinas Inestables Anemia Hemolítica de Cuerpos de Heinz Congénitos, (CHBA) (Congenital Heinz body hemolitic anemia) Tipo 2: Ruptura Estructura Secundaria de -hélice. Prolina no puede participar excepto como parte de uno de los tres residuos iniciales. Hay sustituciones de Pro Tipo 3: Mutaciones en la zona de contacto 11 Tipo 4 : Deleciones de aminoácidos Tipo 5: Cadenas Alargadas

Mecanismo de formación de los Cuerpos de Heinz Autoxidación ión superóxido Los hemicromos son moléculas de metahemoglobina en las que la quinta o sexta posición de coordinación con el hierro se une en otra posición de la normal, generando una distorsión de la molécula

Formación Cuerpos Heinz OxiHb (6HS) Formación Cuerpos Heinz NADH NAD+ - Superóxido dismutasa MetaHb (6HS) + O2 Hb sin hem Hemicromo 1 (Reversible) Hemicromo 2 (Irreversible) R H2O2 GSH Catalasa Cadenas precipitadas Precipita (4 HS) I Glutation peroxidasa GSSG Cuerpos de Heinz (unido MP) H2O LISIS

Mecanismo de Hemólisis: Una teoría propuesta como mecanismo de hemólisis seria la siguiente (1º) un aumento de la oxidación y fosforilación de tirosina en la proteína AE1; unión de los hemicromos a la proteína Banda 3 (2º) reclutamiento progresivo de AE1 fosforilada en grandes complejos en membrana lo cuales contienen hemicromos y (3º) paralela lisis de los eritrocitos y una masiva liberación de vesículas que contienen hemicromos. AE1, anion exchanger1 =Banda3.

II-Mecanismos de Remoción Fagocítica de Eritrocitos La secuencia de eventos sería: a- Unión de los hemicromos a la proteína Banda 3, b- Oxidación de los dominios citoplasmático de Banda 3, c- Generación de agregados de alto peso molecular de Banda 3 (clustering de banda 3) que une IgG y complemento, d- Opsonización con Ac anti- Banda3 e- Reconocimiento por parte del sistema mononuclear-fagocítico y fagocitosis por macrófagos.

Clasificación según Fenotipo I-Propiedades físico-químicas alteradas A-HbS (polimerización deoxiHb S): síndromes drepanocíticos B-HbC (cristalización): anemia hemolítica, microcitosis II-Variantes de Hemoglobina Inestables A-Anemia hemolítica de cuerpos de Heinz Congénita III- Variantes con afinidad al O2 alterada A-Variantes con alta afinidad: eritrocitosis B-Variantes con baja afinidad: anemia, cianosis IV-Hemoglobina M  A-Metahemoglobinemia, cianosis. V- Variantes que causan un fenotipo talasémico

Variantes de Hemoglobina con afinidad alterada al O2 Mutaciones que causan sustituciones de aminoácidos que afectan el equilibrio entre los estados R y T El BPG (rojo) se une a la cavidad central de Hemoglobina. Tiene una carga de -5 y esta rodeado por 8 grupos cationicos (azules). En el estado R, la cavidad central es muy angosta para contener el BPG. El BPG se une en el estado T. Esto desplaza el equilibrio TR hacia el estado T  baja la afinidad de la Hemoglobina por el O2

III-

Clasificación según Fenotipo I-Propiedades físico-químicas alteradas A-HbS (polimerización deoxiHb S): síndromes drepanocíticos B-HbC (cristalización): anemia hemolítica, microcitosis II-Variantes de Hemoglobina Inestables A-Anemia hemolítica de cuerpos de Heinz Congénita III- Variantes con afinidad al O2 alterada A-Variantes con alta afinidad: eritrocitosis B-Variantes con baja afinidad: anemia, cianosis IV-Hemoglobina M  A-Metahemoglobinemia, cianosis. V- Variantes que causan un fenotipo talasémico

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