MICROSCOPIA

INTRODUCCIÓN Los microorganismos son demasiado pequeños para ser observados a simple vista, por lo cual debe utilizarse un microscopio. La palabra microscopio deriva del vocablo latino micro, que significa pequeño, y del vocablo griego skopos que significa mirar. Los microbiólogos utilizan los microscopios que producen aumentos de 10 a 1000 veces mayores que los lentes simples de Voa Leeuwenhoek

UNIDADES DE MEDICIÓN Como los microorganismos y las partes que los componen son tan pequeños, se miden en unidades que son poco familiares para muchos de nosotros en la vida cotidiana. Para medir los microorganismos se utiliza el sistema métrico, cuya unidad estándar de longitud es el metro (m). Los microorganismos y sus componentes estructurales se miden en unidades aun más pequeñas, como los micrómetros y los nanometros.

Un micrómetroμm es igual a 0,000001m o 10-6 m. Un nanómetro nm es igual a 0,000000001m o 10-9m.

Los instrumentos El microscopio simple utilizado por Anton van Leeuwenhoek en el siglo XVII tenia una sola lente y era similar a una lupa. Tallaba sus lentes con tal precisión que una lente sola podía aumentar un microorganismo 300x y gracias a sus microscopios simples fue la primera persona que pudo ver a las bacterias

MICROSCOPIO ÓPTICO El término microscopia óptica se refiere al empleo de cualquier clase de microscopio que utilice luz visible para observar las muestras.

MICROSCOPIO OPTICO COMPUESTO Tiene una serie de lentes y utiliza luz visible como fuente de iluminación. Con el microscopio óptico compuesto es posible examinar muestras muy pequeñas además de algunos detalles más finos. Un conjunto de lentes finamente talladas forma una imagen focal definida cuyo tamaño es muchas veces mayor que la muestra en sí. Este aumento se logra cuando los rayos luminosos procedentes de la fuente de luz pasan a través de un condensador, que tiene lentes que dirigen los rayos de luz a través de la muestra.

Sistema óptico: está formado por un cuerpo tubular donde se instalan las lentes: los oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto.

PARTES

Soporte: Es la pieza fija en la que sólo la platina y el condensador tienen un cierto movimiento. Sus principales partes son: Base: Normalmente alberga la fuente de iluminación, en determinados modelos incorpora además, un sistema portafiltros con varios filtros y un diafragma de campo luminoso. Brazo: Soporta todo el sistema óptico, el cabezal porta oculares y el revólver portaobjetivos. En él se dispone también un sistema de anclaje de la platina.

Condensador: enfoca la luz a través de la muestra

Diafragma: regular la cantidad de luz que atraviesa la muestra

Tornillo de enfoque: A. Macrométrico B. Micrométrico

Los tornillos macrométrico y micrométrico: ambos permiten enfocar la preparación. El primero se emplea para un enfoque rápido cuando se trabaja con objetivo de menor aumento (10x), mientras que el segundo permite fijar el enfoque cuando se utilizan los objetivos de mayor aumento (40x, 100x).

Platina: Es la pieza donde se coloca la preparación microscópica para su observación.

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SISTEMA OPTICO Lente ocular Lente objetivo Condensador Diafragma Fuente de luz 

SISTEMA MECÁNICO Soporte Platina Cabezal Revólver Tornillos de Enfoque

El aumento se logra cuando los rayos luminosos procedentes de la fuente de luz pasan por el condensador, que tiene lentes que dirigen los rayos pasan al interior de la lente objetivo, la lente más próxima a la muestra. La imagen de la muestra vuelve a ser ampliada por el ocular

AUMENTO TOTAL Se calcula mediante la multiplicación del aumento (potencia) del objetivo por el aumento (potencia) del ocular.

La mayoría de los microscopios utilizados en microbiología poseen varias lentes objetivo, que proporcionan 10x bajo aumento, 40x gran aumento y 100x de inmersión en aceite. La mayoría de los oculares amplían la imagen 10 veces. Al multiplicar el aumento de un objetivo específico por el ocular se observa que el aumento total puede ser de 100x con bajo aumento

La RESOLUCIÓN Es la capacidad de las lentes de distinguir detalles finos o, más específicamente, la capacidad de distinguir una distancia separada determinada entre dos puntos como objetos separados si están al menos a 0,4 nm de distancia. Un principio general de la microscopia es que cuanto más corta sea la longitud de onda de la luz utilizada en el instrumento mayor será la resolución.

En óptica, la apertura numérica (AN) de un sistema óptico es un número adimensional que caracteriza el rango de ángulos para los cuales el sistema acepta luz. En microscopía, la apertura numérica es importante porque indica el poder de resolución de una lente. El tamaño del detalle más pequeño que puede ser visualizado es proporcional a λ/AN, donde λ es la longitud de onda de la luz empleada. Una lente con una apertura numérica grande será capaz de visualizar más detalles que una lente con una apertura numérica más baja no podrá. Además, las lentes con aperturas numéricas grandes aceptan más luz y dan una imagen más brillante.

Letra F Letra…….. / Aumento……………….. Observar y describir - Aspectos de la letra F observada al Microscopio óptico. - Características de la imagen obtenida - Que ocurre con la imagen si el preparado se desplaza hacia la derecha o izquierda PONER UNA IMAGEN DE LA LAMINA CON LA LETRA F USAR UN MARCADOR FINO.. NO UNO GRUESO!!!

Para obtener una imagen clara con detalles precisos en el microscopio compuesto las muestras deben teñirse para que contrasten nítidamente con el medio que las rodea, es decir con la sustancia en las que están suspendidas. Para lograr ese contraste es necesario cambiar el índice de refracción de la muestra con respecto al del medio. Tras la coloración cuando los rayos atraviesan 2 materiales con distinto índice de refracción, los rayos cambian de dirección y entran en las lentes oculares; por consiguiente aumenta el tamaño de la imagen

Para lograr un aumento de 1000x con buena resolución el objetivo debe ser pequeño. Aunque es deseable que la luz atraviese la muestra y el medio se refracte de forma diferente, no deben perderse rayos de luz que hayan atravesado de la muestra teñida. Para conservar la dirección de los rayos de luz en el máximo aumento se utiliza el aceite de inmersión y mejora el poder de resolución de las lentes

TIPOS DE MICROSCOPIOS Microscopio Óptico Simple Lupa Microscopio M.O. Normal Campo oscuro Contraste de fases Fluorescencia Microscopio Óptico Compuesto Tipos de microscopios Transmisión Barrido Digital Efecto túnel o cuántico Microscopio electrónico

Microscopio óptico de campo claro: en condiciones habituales el campo de visión está iluminado de forma brillante,

Microscopio de campo oscuro: se utiliza para examinar microorganismos vivos que no son visibles en el microscopio óptico común, no pueden teñirse con los métodos estándares o que resultan tan distorsionados por la tinción que no pueden identificarse

Microscopio de contraste de fases: permite la observación detallada de estructuras internas en los microorganismos vivos

Microscopio de fluorescencia: aprovecha las ventajas de la fluorescencia.

Microscopio electrónico: se utiliza para los objetos menos de 0,2μm como virus o estructuras celulares internas. Se utiliza un haz de electrones en vez de luz

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO Compruebe que las lentes del ocular y de los objetivos están limpias: de no ser así límpielas cuidadosamente con papel especial para óptica. No tocar la lente con los dedos. Coloque la preparación (sin el cubre objetos) y con la muestra en la parte superior sobre la platina sujetándola con el dispositivo móvil. Compruebe previamente, que el objetivo de menor aumento está en posición de empleo. Para bacteriología, iluminar la preparación bajando el condensador (más contraste) y con el diafragma abierto.

  Ajuste los binoculares a la distancia interpupilar y ajuste el foco de cada ocular si el microscopio lo permite. Coloque el objetivo de 10 aumentos (10x) y enfocar. Acerque al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando para ello el tornillo macrométrico. No realizar dicha preparación mirando por el ocular, pues correría el riesgo de clavar el objetivo en la preparación con el consiguiente destrozo de ambos. Enfoque con el micrométrico observando por el ocular hasta obtener un enfoque nítido.

Pase al objetivo de 40 aumentos 40x Suba ligeramente el condensador Pase al objetivo de 40 aumentos 40x Suba ligeramente el condensador. La imagen debe estar casi enfocada, afine el foco con el micrómetro. Si la imagen no está ni medianamente enfocada, es preferible volver con el objetivo de 10x. El objetivo de 40x trabaja muy cerca de la preparación y por ello es susceptible de dos tipos de accidentes: ser clavado en la preparación y resultar manchado con aceite de inmersión si se observa la preparación ya usada con éste último.

Empleo del objetivo de inmersión Gire el revólver hasta la posición del objeto de inmersión, dejándolo a medio camino entre éste y el objetivo de 40x. Coloque una gota de aceite de inmersión sobre el punto de la luz. Termine de girar el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión, asegurándose de que este no toca la preparación pero sí la gota de aceite. Enfoque cuidadosamente con el micrómetrico. Recuerde que la distancia entre el objetivo y la preparación es mínima.

Una vez que ya ha puesto aceite de inmersión sobre la preparación ya no puede volverse a colocar los objetivos de 10x y de 40x sobre ese campo. Por lo tanto, si desea enfocar otro campo, debe retirar el objetivo de inmersión girando el revólver hacia el objetivo de menor aumento 10x, seleccionando otro campo y empezando a enfocar desde éste último. Finalizada la observación de una preparación, y antes de retirarla de la platina, se colocará el objetivo de menor aumento girando el revólver en el sentido de la lupa. Nunca retire la preparación con el objetivo de inmersión en posición de observación

Retire la preparación y limpie el objetivo de inmersión cuidadosamente con un papel especial para óptica. Compruebe también que el objetivo de 40x está limpio.

MANTENIMIENTO Y PRECUCIONES No se beben tocar nunca las lentes con las manos, sino con pañuelos especiales para lentes No dejar nunca una preparación Para cambiar el objetivo siempre utilice el revolver Después de utilizar el objetivo de inmersión límpielo. En caso de que el aceite se haya secado se debe limpiar con xilol. No cambie nunca de objetivo mientras está observando a través del ocular Cuando finalice el trabajo ponga el objetivo de menor aumento en posición de observación Cuando se finalice el trabajo ponga el objetivo de menor aumento en posición de observación. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión de práctica.