CONCEPTOS BÁSICOS BIOLOGÍA MOLECULAR I DR.JP FLORES G.

Biología Molecular en Patología Las pruebas moleculares permiten examinar la estructura y expresión de genes específicos o proteínas en tejidos normales, anormales o neoplásicos . Con la finalidad de evaluar posibilidades de diagnóstico, tratamiento o pronóstico en una gran variedad de patologías .

DNA

Secuencias de nucleótidos unidos consistentes en : Ácidos Nucleicos Secuencias de nucleótidos unidos consistentes en : Base Nitrogenada Azúcar de 5 carbonos Grupo fosfato La secuencia de las bases es la forma en que la información genética es almacenada

Bases Pirimidinas Las bases C= , A= y G= Citosina ( C= ) Timina ( T= ) Uracilo ( U= ) Purinas Adenina ( A= ) Guanina ( G= ) Las bases C= , A= y G= se encuentran en el DNA y en el RNA. Sin embargo la base T= es específica para el DNA y el U= es específica para RNA.

Complejo DNA/Proteína RNA mensajero RNA ribosomal Transcripción Amplificación

Cromosoma/Gene

Delecion Duplicación

Traslocación Inversión

Replicación celular Reactivación 1 Hr. 6 a 12Hs. 3 a 4 Hs. 2 a 4 Hs.

Replicación celular Conceptos sobre replicación celular: Interfase Duplicación del material fenotípico y genético Doblar tamaño trascripción y trasducción de los genes Diploide de cromosomas

Cromosoma/Gene

Conceptos Cancer Cancer es una enfermedad genética Protooncogenes (dominantes) Genes supresores (Recesivos) Genes que regulan la muerte celular programada o Apoptosis Genes relacionados con la reparación del ADN. (Inestabilidad ADN)

Conceptos Cancer Inmortalización Transformación Ventajas de crecimiento Metastasis Contenido ADN aneuploide Alts. Genéticas

Biología del crecimiento tumoral Transformación Crecimiento Invasión local Metástasis Cinética del crecimiento Angiogénesis Heterogeneidad

Masa tumoral: formada por descendientes clonales de una célula transformada .

Cinética del crecimiento Regulación del ciclo vital alterado (Rb, p53 y ciclinas) Posteriormdisminuye (20%) Fracción de crecimiento elevada (# de células tumorales en proliferación, [FC]) Duración de ciclo vital igual o mayor Crecimiento producción = pérdida celular Vel de crecim

Cinética de Crecimiento Quimioterapia actúa sobre células que se encuentran en su ciclo celular. Tumor Factor de crecimiento Aplicación de quimiotx Respuesta Agresivo No agresivo Sin cirugía Cirugía

Distancia de máxima difusión de óxígeno Angiogénesis Tumoral Elemento Nutritivos y O2 Factores de crecimiento (PDGF, GM-CSF, IL-1) Metástasis Distancia de máxima difusión de óxígeno (1-2mm)

clon célula mutación tumor Fenotipos de angiogénesis mutada libre Normal = p53 Nat sx trombospondina - 1 antiangiogénesis mutada libre Tumor =p53 Niveles trombop. Angiogénesis clon célula mutación tumor Multiples mutaciones Fenotipos de angiogénesis

También hay Control de anti-angiogénesis sx Trombospondina -1 Angiostatina Endostatina Vasculostatina Degradacción del plasminógeno, colágena y transrretina sx

Progresión y heterogeneidad de los tumores Progresión tumoral: La malignidad se adquiere de forma progresiva 1 Preneoplásico - tumor benigno -tumor maligno Crecimiento acelerado Capacidad de invasión Metástasis

Biología del crecimiento tumoral Transformación Crecimiento Invasión local Metástasis Cinética del crecimiento Angiogénesis Heterogeneidad

Invasión de la matríz extracelular Proceso activo que se divide en varios pasos 1) Separación de células tumorales del resto de la masa. 2) Fijación a los componentes de la matríz. 3) Degradación de la matríz extracelular. 4) Emigración de las células tumorales. Membrana basal y tejido conjuntivo. Colágeno, proteoglucanos y glucoproteinas.

Disminución de cadherina E r/o Mutación cateninas.

Rc laminina, fibronectina y expresión de integrinas.

Enzimas proteolíticas (propias del huesped) Serina, Cisteina de la matríz (MPM)

Factores de motilidad autocrino (timosina, fc.Crecim. hepatocitario) Productos de degradación de los componentes de la matríz.

Diseminación vascular y asentamiento de las células tumorales Penetran en circulación y se agupan entre ellas y con células sanguineas (plaquetas) Viajan como embolo y se extravasan hacia organo diana (moleculas de adherencia - CD44) Tropismo orgánico Ca próstata - esqueleto Ca broncogenico - suprarrenal y encéfalo Neuroblastomas - hígado y hueso

Tropismo Orgánico Células tumorales: molécula adherencia con preferencia a células endoteliales del órgano diana. Célula diana: liberan sustancias quimiotácticas. Organo diana: ambiente desfavorable.

Genética molecular de las metástasis “Gen metastásico” Genes supresores de la metástasis. - Gen de cadherina E. - Gen de inhibidor histico metaloproteasas. - nm23 ca mamario - KA I-1 (crom IIp II-2) ca próstata - Kiss-1 (crom IIp) melanoma maligno

Carcinogénesis 1.- Cambio en la función de un gen 2.- Función anormal de un gen 3.- Cambios estructurales de los genes Sin alteración cromosómica no existe transformación neoplásica

Proliferación Célula suceptible Factores ambientales Virus, radiación Diferenciación genes Apoptosis Célula suceptible Genes asociados a proliferación celular

Mecanismos moleculares CA Colon Mutaciones APC Y MCC Perdida de gpos. Metilo ADN Mutaciones del Gen RAS Perdida de Gen DCC Perdida de P53

Adenoma plano

Oncogenes Seminars in Oncology Vol.23:4-21 1996 Oncogen Función Tumor HST Crecimiento Ca.gástrico NEU/ERB-2 Crecimiento Ovario,mama TRK Crecimiento Ca.tiroides,Colon HaRAS,K-RAS, Trasduccion Ca.vejiga,Colon de proteínas ABL Cinasas de proteínas Leucemia/Linfoma MYC/BCL2 Factores de Trasduccion Neuroblastoma Nucleares Linfomas Seminars in Oncology Vol.23:4-21 1996

Gen supresor tumoral Alteración de la funcionalidad de ambos alelos de un gen que regula la diferenciación celular o la supervivencia la pérdida de estos resulta en la transformación maligna.

P53 Guardian ADN

Genes Supresores Tumorales Gene S. Familiar T.Esporádicos c/Mutación Mx de Acción RB1 Retinoblastoma RB,OSC,Pulmón,Mama Ciclo Celular P53 S.Li-Fraumeni 50% canceres Daño DNA P16 Melanoma,Ca.Pancreas Ca.pancreas,Gliomas Inhibidor CDK hMSH-2 Ca.Colon Ca.Colon,Endometrio Reparación DNA hMLH-1 APC Pólipos adenomatosos Ca.Colon Wnt factores crecimiento BRCA1 Ca.Mama,Ovario Ovario(raro) Reparación DNA ? BRCA2 Ca.Mama,Ovario,Páncreas Ca.Páncreas Reparación DNA? NF-1 Neurofibromatosis tipo 1 Neuroblastoma Melanoma Ras NF-2 Neurofibromatosis tipo 2 Meningioma, Mesotelioma M.Citoesqueleto Shwanoma,Ependimoma

ADN Molecula de Estrogeno Receptor de estrogenos Respuesta Mediada RNAm

Evidencia a favor de Efecto hormonal en Adenocarcinoma de Mama Pacientes con ooforectomia rara vez desarrollan cancer de mama Pacientes con S de Turner rara vez desarrollan ca de mama Xenoestrogenos favorecen el desarrollo de ca de mama Los pacientes con RE positivos responden a terapias con tamoxifen

Microorganismos oncogénicos Agentes Carcinógenos Químicos Energía radiante Microorganismos oncogénicos

Carcinogénesis Química John Hill - rapé -pólipos Percival Pott - hollín - ca escroto Hidrocarburos aromáticos policíclicos Sustancias sintéticas Fármacos

Fase de la carcinogenesis química Iniciación y promoción

INICIACION acción directa Naturales ó sintéticos acción indirecta ó procarcinógenos Activación (carcinogeno) Inactivación (destoxificación) Monooxigenosa dependiente de citocromo P-450 CYP1A1, Stransferasa (BST), edad, sexo, nutrición

CARCINOGENOS QUIMICOS Indicador mutágeno Diana DNA Cada carcinógeno produce una “huella dactilar” molecular China y Africa aflatoxina B1 Ca. Hepatocelular - mutación p53 mutación 249 p53. Otras Otras regiones V Hepatitis B. Otras mutaciones en p53 P/iniciación: Celulas alteradas por carcinógeno deben sufrir al menos 1 ciclo de proliferación

PROMOCION Capacidad carcinogénica de alguna sustacias cuando se administra un promotor que por si mismo no es tumorgénico TPA, Acido ocadoico NUEVAS INICIADOR PROMOTOR MUTACIONES Proliferación y Actividad de un expansion cronal de Tumor oncogen células indicadas maligno Nada Lesión Lesión hiperplásica preneoplasica

CARCINOGENOS QUIMICOS Agentes alquilantes de acción directa Hidrocarburos aromáticos policíclicos Aminas aromáticas y colorantes nitrogenados Carcinógenos naturales Nitrosaminas y amidos Agentes diversos Promotores de la carcinogenesis química

CARCINOGENESIS POR RADIACIÓN Rayos UV (UVA, UVB, UVC) R. Ionizante (electomagnetico o particular)

RAYOS ULTRAVIOLETA UVA 320-400nm UVB 280-320nm carcinógeno UVC 200-280nm carcinógeno, filtrado por capa 0Z0NO Epidemiología - Ca. Espinocelular, basocelular, melanoma Factores: Tipo de UV, Intensidad exposición, cantidad melanina

NER ( nucleotide excision repair) 1) Reconocimiento 2) Incision 3) Eliminación 4) SX parche 5) Unión del parch sobrepasa capacidad sol NER error en DNA transcripción dañado Xeroderma pigmentoso

XERODERMA PIGMENTOSUM Autosómico recesivo Fotosensibilidad extrema riesgo ca(2000 veces) Anomalías neurológicas Incapacidad p/reparar DNA por lesiones UV 7 variantes

- Mama, pulmón y glándula salival RADIACIÓN LONIZANTE Cualquier célula podrá transformarse en cancerosa si recibe una cantidad suficiente de energía radiante Ca provocado por radiación: Piel, hueso y TGI: son los menos involucrados - Leucemias - Ca. Tiroides - Mama, pulmón y glándula salival

EJEMPLOS Rayos roetgen - Ca. Piel Mineros de elem radioactivos – Ca. Pulmón (10 v+) Bombas Hiroshima y Naggsaki – 7 a: leucemias a: tumor solido R. Terapeuticos: Cabeza y Cuello = 9% CA tiroides : Columna x E.A= leucemia (10-12 v+) Accidente Chernobil - Ca. Tiroides mama, tiroides colon, pulmón

CARCINÓGENOS VIRALES Y MICROBIANOS Virus DNA oncogenicos (VPH, VEB) Virus RNA oncogenicos ( VLTH-1) Bacterias (Helicobacter pylori)

VIRUS DNA ONCOGENICOS -VPH 70 Tipos VPH 1, 2, 4, 7 prod papilomas escamosos benignos 6, 11 condiloma genital con escaso pontencial maligno 16, 18 (31, 33, 35, 51) Ca in situ 85% y Ca invasores Lesión preneoplásica - Forma episómica del VPH Lesión neoplásica - Forma integrada del VPH. (clonal) ciclo NL - - (-) transcripción - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - normal E1 / E2 E6/E7 E6 E6 PRB p53-P INFECT - - - Interrupción - - codifica E6/E7 cant gran afinidad VPH 16, 18, 31 E6 P53-a VPH - - - - Interrupción - - codifica E6/E7 cant poca afinidad Alteración leve bajo riesto del ciclo celular Regulación del ciclo células alterado 7 veces > riesgo de Ca. que

Virus DNA oncogénico VEB

Antigenos Tumorales AET - Solo en células tumorales, desencadenan a células T citotóxica y se presentan sobre la celular por molecula I MHC. AAT - Genes en células normales (pero no expresado) y en células tumorales. Fam. Genes MAGE, GAGE, BAGE, RAGE. Expresión excesiva de antigenos c-erb B2 (o neu) - en células tumorales su expresión y activa a linfos T CD8 citotox. Antigenos virales E7 del VPH-16 Antigenos de diferenciación CD10 (CALLA) - Leucemias y Linfomas B Ag prostático específico

Mecanismos Efectores Antitumorales

Inmunovigilancia SIDA, XLP. Otras inmuno del - 220 veces > prob. de Cancer Dx sanos - mecanismos p/evadir inmunodeficiencia - células tumorales no expresan HLA clase I - no expresan moleculas coestimulantes - inhiban respuesta inmune ((+) LT supresor) - apoptosis de células T citotox. (ligados FAS)

Efectos del tumor en el huesped Daño por : - localización y efecto de masa - actividad funcional - hemorragias o infecciones -sintomas agudos

Efectos locales y normales Tumor endocrino benigno endocrinopatia Cancer en una glándula insuficiencia Cancer colon obstrucción Presión tumor benigno Erosion y destrucción tumor maligno

Caquexia Síndrome: Pérdida de grasa y masa corporal con dedebilidad, anorexia, anemia - Alteación: gusto y olfato - Gasto Calórico e indice metabólico basal - Es reproducible al administrar FNT

Síndrome Paraneoplásico Signos y síntomas de un px. con Ca. que no se explica por efecto del tumor local, metástasis ni actividad funcional. Producción hormonal ectópica (Cushing) 50% Ca. Pulmón Hipercalcemia (mama, pulmón, riñón, ovario) Síndrome neuromiopático: Ac anti tumor Rx cruzada c/neuronas Acantosis Nigricans: 50% con 40 años y Ca. Osteoartropatía hipertrófica: 1-10% de Ca. Broncogénicos

Graduación y estadificación de los tumores Mediante - grado de diferenciación y mitosis existentes Es proporcianal a la agresividad (I - IV) 2 Sistema 1 UICC = Sistema TNM TO= in situ, T1 - T4 tamaño NO= no ganglios, N1 - N3 # ganglio afectados MO= no mets MI - mets presente Mz - Mets Hematógena 2 AJCC - O - n Tamaño, ganglios, metástasis

Diagnóstico del cancer Histológico y citológico Inmunotinción Diganóstico molécular Citometría del Flujo Marcadores Tumorales Datos clínicos muestra adecuada y representativa material bien fijado por BAAF, biopsia, BTO técnica de apoyo

Historia Tinción facilita la distinción diferentes componentes celulares. HyE Weigert, Harris, Mayer 1939 Histoenzimología 1942 Coons Inmunoflourescencia 1972 Nakane-Avrameas Peroxidasa 1980 Hsu Complejo Avidina –Biotina 1972 Stenberg PAP 1992 Adams Ampificación Tirimidina

Tinción especial Subjetividad histopatologia Identificar célula en particular , tejido o enfermedad Técnica auxiliar Sensibilidad y especificidad aceptable en el diagnóstico morfológico Posibilidad de clarificar la histogénesis

1940 1950 1960 1970 1980 1990 Telepatología 3D Morfo In situ PCR Computadoras HIS PCR IHQ Biología Molecular Histoquímica Inmunología ME Química Bioquímica Física 1940 1950 1960 1970 1980 1990

Métodos en Patología Qx. Macroscopico Microscopia luz Histoquimica Inmunohistoqx. Ultraesructura Citopatologia CFU Análisis de Imagen Hibridización In situ PCR FISH

Macro melanosomas IHQ PAS HISF

Inf. Clínica Técnica Especimen Resultados

Consideraciones Técnicas Especimen: Bloques celulares Citología o frotis secado al aire Citologías teñidas previamente Citologías BAAF Transferencia de células

Transferencia de celulas PAP HMBE-1 ACE CK8

Logística de Estudio Lesiones Neoplásicas Citopatología Evaluación Clínica y sitio de la lesión Grupos Morfológicos I. Epitelioides II. Fusocelulares III. Mixtos IV. Células pequeñas Panel Racional Inicial Citopatólogo CA vs. Melanoma CA vs. Linfoma Linfoma vs. TNEP CA sarc. vs. Sarcoma DX. Diferencial

PLAP

Réglas Básicas Interpretación G.secretorios Filamentos Filamentos Sinaptoficina CK8 Actina Cromogranina

Réglas Básicas Interpretación Lámina basal Filamentos Filamentos Filamentos Colagena IV Desmina Actina

Historia Clinica 1 Paciente masculino campesino de 58 años de edad con tumor en region cervical Tele de Torax normal TAC normal Estudios de laboratrio dentro de limites normales

Diagnosticos diferenciales Melanoma Histocitoma Fibroso Maligno Carcinoma sarcomatide Sarcoma epitelioide

HMB45 CK 13 Cocktail CK CD 68 Negativo Prot S-100 negativo CK8 negativo CK 7 Negativo CD 10 Negativo Carcinoma Espinocelular sarcomatoide

Inmunofenotipo Patología Quirúrgica Proceso reactivo vs. Neoplásico Linfoma vs. Neoplasia no Linfoide Inmunotipificación de Linfomas

Protocolo de Estudio Lesiones Neoplásicas Poco Diferenciadas ME, PCR BM G. Morfológicos I. Epitelioides II. Fusocelulares III. Mixtos IV. Células pequeñas Evaluación Clínica y sitio de la lesión No Concl. Dx Def. Morfología Panel p/ SC Panel Dx Inicial Dx. Histogenetico

Clasificación de tumores indiferenciados CK epitelial VIM mesenquimatoso Des muscular PAGF gliales ACL linfomas APE tiroglobulina - ca específico

Diagnóstico molecular Diferenciar población polimonoclonal Detección de traslocaciones por FISH Detección de transcripción por PCR Determinar el pronóstico Detección de enfermedad residual por PCR Predisposición hereditaria BRCA1, BRCA2 RET.

Diagnóstico Pronóstico y R=Tx Selección y manejo Tx.génico

Personas normales 1 1 2 1.00- 8030 D 2l de DNA 1. 00- 8030 D 1l de DNA 2. 00- 4572 B ZP3 ZP3 Her-2/Neu Her-2/Neu N° de copias Pacientes M marcador de peso molecular 3. 01- 330 B 4. 00- 733 A 5. 01- 146 M 6. 01Q- 1226 HSJ 7. GG- 866- a 8. 01Q- 658 9. GG- 3275D 10. 01Q- 815B 11. 01Q- 1111B 12. 01Q- 978B 1 10 M 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2 28 3 11 4 10 ZP3 5 10 6 12 Her-2/Neu 7 12 8 24 9 08 10 24 11 04 12 02

Citometría de flujo - Identificación de antígenos de superficie - Aneuploidia pronóstico Marcadores tumorales - Apoyo al diagnóstico - Indican recidiva - Establece respuesta al tratamiento (AFP, CEA, HGC, etc)

Gracias por escuchar A mi papá.