UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS - ESPE DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA Optimización de un método de identificación del genotipo sexual mediante microsatélites en tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus), en las piscinas de reproducción de Aquatilgen Cía. Ltda. - lago agrio PREVIA A LA OBTENCIÓN DE GRADO ACADÉMICO O TÍTULO DE: INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA GUSTAVO ADOLFO NARANJO MENESES Agosto, 2014

Cultivo de Tilapia en el Ecuador INTRODUCCIÓN 2da especie de pez mas cultivada 4,5 millones toneladas en el 2012 ¾ de la producción corresponde a O. niloticus Gran aceptación del mercado Cultivo de Tilapia 10 productor mundial 40 mil toneladas en el 2012 Mayor exportador de filete fresco en USA Alternativa productiva rural Cultivo de Tilapia en el Ecuador

Tilapia del Nilo (Oreochromis niliticus) JUSTIFICACIÓN Tilapia del Nilo (Oreochromis niliticus) Cultivo solo Machos Mayor Crecimiento Poca reproducción Mayor Rentabilidad Ventajas Reversión sexual >98% de machos Contaminación con hormonas Tecnología de Machos YY 100 % machos Libre de uso de hormonas Metodologías mas usadas Difícil obtención de individuos YY Procedimiento largo Ausencia de pruebas de identificación del genotipo sexual Problemas en tecnología de machos YY

OBJETIVOS General Optimizar una técnica de detección del genotipo sexual mediante microsatélites en la población de tilapia del Nilo presenté en las piscinas de reproducción de Aquatilgen Cía. Ltda. Específicos Optimizar la extracción de DNA de muestras de aletas de tilapia con un el kit PureLink Genomic DNA. Optimizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR convencional) para los microsatélites UNH898, UNH995 y UNH104, los cuales presentan alta ligación con el sexo. Así cómo la metodología de detección de los productos de PCR por electroforesis vertical en poliacrilamida. Identificar los alelos y los genotipos presentes en la población para cada microsatélite. Identificar y seleccionar el microsatélite que presente mejor dependencia con el genotipo sexual. Evaluar la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo del microsatélite seleccionado para diferenciar los genotipos sexuales.

METODOLOGÍA Especímenes : 30 Hembras normales --> XX TOMA DE MUESTRAS Especímenes : 30 Hembras normales --> XX 40 Machos normales --> XY 30 Súper machos --> YY Obtención de muestras de la aleta pectoral. Muestra preservada en alcohol absoluto a -20o C y transportada a 5°C Piscinas de Reproducción de Aquatilgen Cía. Ltda Lago Agrio - Ecuador

GENOTIPAJE Laboratorio de Recursos Bioacuáticos y Acuacultura IASA 1. Extracción de DNA  Kit PureLink Genomic DNA (Invitrogen) Cuantificación de DNA  Kit Qubit® dsDNA BR Assay (Invitrogen) Determinación de contaminación de RNA y proteínas Electroforesis en Gel de Agarosa al 0,8% y por espectrofotometría en microplacas. Amplificación de los microsatélites  PCR convencional Análisis de productos de PCR  Geles no denaturantes de poliacrilamida al 8%, seguido de análisis en el software QuantityOne Laboratorio de Recursos Bioacuáticos y Acuacultura IASA 1.

Análisis de datos Identificación de Alelos relacionados con los cromosomas Frecuencias alélicas y genotípicas categorizadas por el genotipo sexual Dependencia con el genotipo sexual Prueba de Independecia Chi-cuadrado: Marcador vs. Genotipo sexual. Marcador con el menor valor-p seleccionado. Confiabilidad de marcador Diferenciar: 1°.- Machos vs Hembras 2°.- YY vs XY Sensibilidad, Especificidad, VPP y VPN

RESULTADOS Extracción de DNA DNA > 10 Kb DNA No fragmentado Presencia de RNA Contaminación con proteínas 1,8 – 2  DNA puro

Validación de PCR Tamaño de bandas esperado (Lee et al., 2003; Eshel et al., 2011; Khan, 2011): UNH995  160-240 UNH898  250-300 UNH194  130 - 18 Sin Inespecíficos Ausencia de contaminación de Reactivos 180 a 250 BP 220 a 230 BP 120 a 170 BP

ALELOS RELACIONADOS CON LOS CROMOSOMAS Microsatélite UNH104 Alelos 123 y 127 asociado al cromosoma Y

Alelos 264 y 296 asociado al cromosoma Y Microsatélite UNH898

Microsatélite UNH995 Alelos asociados al cromosoma X Genotipo presentado en machos

Dependencia con el genotipo sexual marcador mas dependiente del genotipo sexual

Evaluación de la utilidad del microsatélite UNH898 en el diagnóstico del genotipo sexual. MACHOS VS. HEMBRAS Altamente sensible para detectar machos

SUPERMACHOS VS. MACHOS Altamente sensible para detectar supermachos

CONCLUSIONES La obtención de las muestras de aleta, no conllevan un riesgo de muerte para el espécimen. La extracción de DNA genómico con el PureLink ™ Genomic DNA mini kit mostro ser eficiente y con una calidad suficiente para realizar los ensayos de PCR sin problema. Con una tasa de recuperación promedio de 284 ng de DNA /mg de muestra seca. La optimización de la PCR para los microsatélites UNH104, UNH898 y UNH995, fue exitosa a las condiciones establecidas, sin productos inespecíficos y el tamaño de banda dentro del rango esperado.

El microsatélite UNH898 (p = 2,91 x 10-28) fue el mas dependiente con el genotipo sexual, seleccionándolo para ser aplicado como método de diagnóstico. Los alelos 296 y 264 del microsatélite UNH898 se presentaron de manera conjunta y están altamente ligados con el cromosoma Y. EL marcador UNH898 mostró ser altamente sensible para diferenciar machos de las hembras (sensibilidad = 96,97% y VPP = 91,43%), y para diferenciar machos YY de machos normales (sensibilidad = 100% y VPP = 85,71%). Se acepta la hipótesis planteada al inicio de esta investigación que afirma que uno de los marcadores está altamente ligado al genotipo sexual y puede predecirlo con una alta confianza.

RECOMENDACIONES Para tener una mayor confiabilidad de los datos se puede ampliar el número de individuos de estudios. O en su caso realizar pruebas de segregación en familias, lo que mostraría con más exactitud el nivel de ligación de los alelos encontrados. Se recomienda utilizar otra metodología de extracción de DNA si se quiere aumentar el número de muestras, ya que la extracción mediante este kit es costosa, a pesar que es relativamente fácil de utilizar. Se recomienda realizar la genotipificación en un sistema de electroforesis capilar con detección por fluorescencia, ya que así podemos tener más confianza en la determinación del tamaño de banda de cada alelo.

AGRAGRADECIMIENTOS