3. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEÍCOS TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO I: CONJUGACIÓN

Células Eucariota y Procariota

ACIDOS DESOXIRRIBONUCLEICO (ADN): ESTRUCTURA

DNA genómico Forma el nucleoíde. Es circular. Tiene entre 4000 a 5500 genes. Tiene un origen de replicación. DNA plasmidíco Es DNA extracromosómico Circular Varían de tamaño Su replicación es independiente del DNA genómico Un origen de replicación único o múltiple. Una bacteria puede tener varios plásmidos diferentes. Le confieren características específicas como: resistencia, patogenecidad y prototrofía.

Clasificación de los plásmidos: 1.- Factores sexuales: autotransferibles, codifican para producción de pili sexuales. (Portadoras F+, no portadoras F_). 2.- Factores de resistencia o Factores R: Codifican la resistencia a antibioticos. Formados por dos componentes denominados “factor de transferencia de la resistencia” (FTR) y determinantes “r”, genes responsables de la destrucción de los antibióticos. 3.- Plásmidos determinantes de patogenecidad: Portan genes que codifican la roducción de sustancias nocivas para el huesped. Plásmidos “Ent”: síntesis de enterotoxinas (E. coli, V cholerae) Plásmidos “Inv”: invasión en células epiteliales (Shigella sp.) Plásmidos “Hly”: alfa-hemolisinas (S. Pneumoniae) 4.- Factores Col: Producción de sustancias antibacterianas similares a los antibióticos (bacteriocinas); colinas (E. coli) piocinas (P. aeruginosa), marcescinas (S. marcescens). 5.- Plásmidos degradantes : Codifican enzimas que las bacterias usan para degradar sustancias como tolueno, alcanfor, salicilatos, cromo, etc. Bacterias del suelo.

Mutaciones Cambios espontáneos, irreversibles y heredables que no dependen de la incorporación de material genético. Las mutaciones se pueden traducir en diferentes tipos: 1.- Morfológicas: cambios en la pared, cápsula, flagelo, etc. 2.- Bioquímicas: Incapacidad de sintetizar algún metabolito produciendo cambios metabólicos. 3.- Patogénicas: cambios en la virulencia bacteriana. 4.- Mutantes letales condicionales: sensibilidad a ciertas condiciones ambientales.

MUTANTES BACTERIANAS Descripción de los distintos tipos de mutaciones en bacterias. Nomenclatura usada para los diferentes tipos de mutaciones. Medio mínimo: Medio básico para el crecimiento bacteriano sin nutrientes adicionales.

Protótrofo: Un microorganismo silvestre que precisa de un medio mínimo con los nutrientes necesarios (agua, iones y fuente de carbono) para sintetiza automáticamente las macromoléculas esenciales. Auxótrofo: Microorganismo mutado que carece de la capacidad para sintetizar un nutriente esencial, y por ello debe obtenerlo (o a su precursor) del ambiente. Son incapaces de crecer en un medio mínimo. Resistencia o suceptibilidad a antibióticos

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO Transferencia de información genética de una bacteria a otra bacteria. Se consideran mecanismos de transferencia horizontal de información genética.

CONJUGACIÓN BACTERIANA Es el proceso de transferencia de información genética desde una célula donadora a otra receptora, promovido por determinados tipos de plásmidos, que requiere el contacto entre ambas células. Los beneficios de la transferencia del material genético al receptor pueden incluir resistencia antibiótica, tolerancia xenobiótica o la capacidad de usar nuevos metabolitos.

CONJUGACIÓN BACTERIANA Para la conjugación se requiere del contacto directo entre ambas células, con intervención de estructuras superficiales especializadas y de funciones específicas: Pili sexuales en Gram negativas (E. coli). Contacto íntimo en Gram positivas (B. Subtilis).

CONJUGACIÓN BACTERIANA: Plásmido F en E. coli Omp A Genes tra tra A= contacto tra D = transferencia de material genético Genes tra, contienen la información para la conjugación, ≅ 25 genes,

Descubrimiento de la conjugación Mezclaron dos cepas doblemente auxótrofas. No había recombinantes sometiendo las células a extractos libres de células. Al añadir Dnasa no se modificaban los resultados. Se observó que necesitaban contacto directo entre las células de las dos cepas.

Si se impide el contacto físico de las cepas con un filtro de menor tamaño que la célula no hay recombinación.

Factor de fertilidad F Existen dos tipos de cepas en la producción de recombinantes: Cepas fértiles (F+): aquellas que al mezclarlas con otras, daban lugar a recombinantes. Cepas infértiles (F-) Factor F es una unidad genética móvil y autónoma codifica genes de contacto y transferencia. Se han identificado alrededor de 60 genes que lo integran. Replicación asimétrica por círculo rodante Los cruces de F+ x F- dan origen a recombinantes. Los cruces de F- x F- no dan origen a recombinantes. Casi la totalidad de células F- adquirían la capacidad de fertilidad al final de la conjugación. Sin embargo las recombinantes aparecían con mucha menor frecuencia

Frecuencia de transferencia de F es mayor a la frecuencia de recombinantes

Cepas Hrf Cepas que provocaban fertilidad a una alta frecuencia (1000 veces más que una cepa F+) A diferencia de las cepas F+, las Hrf no suelen convertir en fértiles las cepas F- tras el cruce conjugativo con ellas. El plásmido F tiene secuencias de inserción El bajo nivel de transferencia del factor F se debe a la presencia de unas pocas células Hrf en la población F+ Lederberg y Hayes

Inserción de plásmido F al genoma bacteriano Recombinación homóloga dependiente de Rec A Frecuencia de integración 10-5 Sitio de Inserción

episoma El factor F va hasta el final. Para que se transfiera el fragmento completo se requiere de 100 minutos episoma Lineal Circular Debido a la integración de factor F en el cromosoma, el factor F no se transfiere completo a la célula receptora, por lo cuál estos cruces no suelen conferir el carácter F+ a los exconjugantes del receptor

La transferencia conjugativa tiene polaridad: La transferencia de DNA en células Hrf es unidireccional y linear. Los genes entran en un orden determinado Generalmente la conjugación se interrumpe antes de que se transfiera todo el Hrf

Factor F´ Es un elemento citoplasmático que contiene parte del cromosoma bacteriano. Es autónomo. Parte del cromosoma que arrastra contiene el gen lac.

F-: Carecen de factor F (receptoras). El factor F puede encontrarse en las bacterias (células) en tres posibles estados formando transformantes de tipo: F-: Carecen de factor F (receptoras). F+: Factor F autónomo, libre en el citoplasma. Hrf: Factor F integrado en el cromosoma bacteriano, no se transmite. F´: Factor F autónomo, con un trozo del cromosoma hospedero integrado, se encuentra en el citoplasma.

En la práctica… Identificar al DNA portador de la información genética. Conocer los mecanismo por los que una bacteria puede adquirir un plásmido. Reconocer a la conjugación bacteriana como un fenómeno de transferencia horizontal de material genético. Entender el mecanismo por el cual se realiza la conjugación baceriana.

Mezclar en un tubo con 1 mL de LB + 300 μL de células E Mezclar en un tubo con 1 mL de LB + 300 μL de células E. coli JM1452Str (Receptora) + 120 μL de células E. coli W3110/F´KmTn3 (Donadora). Dejar Incubar a 37 oC por 1.5 horas sin agitación. Sembrar por estría las bacterias transconjugantes en una caja petri con LB 2% y estreptomicina. Incubar a 37 oC durante 24 h. Martes 4 de Octubre Parchar 50 colonias aisladas del medio LB (estriado del martes) en cajas petri con medio LB con Estreptomicina (1) y medio LB con Kanamicina (2). Incubar a 37oC, durante 24 h. Jueves 6 de Octubre Observar y analizar los resultados Reportar el porcentaje de colonias transconjugantes (las que presentaron resistencia a ambos antibióticos). Viernes 7 de Octubre