SEMINARIOS BIOQUÍMICA I Cromatografía ELECTROFORESIS ADN Recombinante http://minnie.uab.es/~veteri/21206/S.II_electroforesis_09.ppt

INTRODUCCIÓN ELECTROFORESIS Separar y analizar moléculas: proteínas Arne Tiselius 1937 (Nobel 1948) ELECTROFORESIS Separar y analizar moléculas: proteínas ADN/ARN ... en función de su diferente movilidad al aplicar un campo eléctrico (dependerá de su carga eléctrica) cátodo ánodo * Moléc. (+)  polo (-) o cátodo * Moléc. (-)  polo (+) o ánodo ELECTROFORESIS LIBRE moléculas en disolución o suspensión: poco resolutiva La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) según la movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se use. Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente del peso molecular. Para la separación se usa un gel de agarosa o poliacrilamida (fibras cruzadas, como una malla). Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla, por la que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida. ánodo cátodo SOPORTE ELECTROFORESIS DE ZONA SOPORTE que retiene las moléculas: elevado poder de resolución

EQUIPO ELECTROFORÉTICO fuente de alimentación cable * Fuente de alimentación * Cubeta * Tampón de electroforesis * Soporte electroforético (gel) * Dos electrodos ánodo (+) cátodo (-) Componentes: cubeta gel electrodo cátodo ánodo - muestra + - tampón (E. horizontal) + (E. vertical)

FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS 1_ Campo eléctrico *Diferencia de potencial: voltaje (V-voltios) *Intensidad (A-amperios): flujo de carga eléctrica depende de V y de R (Ley de Ohm V=RxI) *Resistencia (R-ohmios): determinada por el soporte y tampón electroforesis *Temperatura: efecto Joule  refrigerantes 2_ Muestra *Carga o densidad de carga: carga eléctrica/masa de la molécula *Tamaño *Forma: formas globulares avanzan más 3_ Tampón de electroforesis *pH: determina la carga de las moléculas generalmente es ligeramente básico  moléculas (-) *Fuerza iónica: moderada (0.05 o 0.1 M) para que no interfiera 4_ Soporte

SOPORTE ELECTROFORÉTICO Gel poroso Características Gel poroso (entramado tridimensional interno) Tiene que permitir el paso de moléculas Material inerte: NO puede estar cargado y no debe adsorber las moléculas de la muestra No restrictivo (Tipo I): Tamaño poro >>> moléculas, no opone impedimento a su paso  separación sólo por CARGA * Electroforesis de proteínas: • Acetato de celulosa, papel, almidón, agar Tipos de Soporte Restrictivo (Tipo II): Tamaño poro ≈ moléculas, opone resistencia a su paso  separación por tamaño (tamizado molecular) * Electroforesis de proteínas: • Separación por CARGA y TAMAÑO • Acrilamida * Electroforesis de DNA/RNA: • Separación sólo por TAMAÑO • Agarosa, acrilamida

EN ACETATO DE CELULOSA: PROTEINOGRAMA Soporte: (no restrictivo) Tiras de acetato de celulosa Electroforesis horizontal muestra Strip + - Campo eléctrico (DV) Avance de las proteínas 1. Aplicación de la muestra 2. Electroforesis 3. Detección por tinción: Azul de Coomassie Negro amido 4. Densitometría Aplicaciones diagnósticas en serología (separación proteínas séricas)

EN ACETATO DE CELULOSA: PROTEINOGRAMA Feline: Feline Infectious Peritonitis Feline: Lymphosarcoma Canine: Leishmaniosis Les proteïnes sèriques són separades habitualment per mitjà d'electroforesi utilitzant com a suport acetat de cel·lulosa. Aquestes tires tenen porus prou amples com perquè les proteïnes es moguin lliurement entre ells. La solució tampó habitual per a les electroforesis de proteïnes sèriques, o proteïnogrames, és una solució de veronal a pH 8.8. A aquest pH, les proteïnes migren cap a l'ànode. Amb aquest mètode es separen entre 6 i 7 bandes, depenent de l'espècie, que corresponen a l'albúmina i als diferents tipus de globulines. Les bandes es posen de manifest mitjançant tinció amb el colorant Negre Amida. Com ja s'ha mencionat, el perfil electroforétic de les bandes obtingudes és diferent segons l'espècie animal. De manera general es pot dir que apareixen quatre bandes que corresponen a l’albúmina, les a-globulines, les b-globulines i les g-globulines. Excepte al banda corresponent a l’albúmina, la resta representen barreges de proteïnes. En alguns casos les a i b-globulines es poden separar en dues bandes cadascuna anomenades a1, a2, b1 i b2. La determinació de la concentració total de proteïnes sèriques i el proteïnograma són paràmetres de gran interès clínic, ja que diversos processos patològics, com a infeccions, alteracions hepàtiques o insuficiències renals, estan associats amb variacions en aquests paràmetres. Equine: Chronic Hepatitis Equine: Inmunodeficiency + Pneumonia

EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE) Soporte: (restrictivo) Gel de Poliacrilamida * Polimerización de dos componentes: Acrilamida + Bisacrilamida * Variación de la concentración  variación del tamaño de poro [poliacrilamida] tamaño poro Electroforesis vertical 1. Preparación del gel 2. Montaje de la cubeta 3. Aplicación de la muestra 4. Electroforesis 5. Detección por tinción: Azul de Coomassie Sales de plata

EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE) Ventajas: * Gran poder de separación por CARGA y por TAMAÑO * Químicamente inertes * Transparentes (permite densitometría) * Estables (pH, fuerza iónica, temperatura) * Versatilidad en cuanto al tamaño de poro y entramado uniforme Aplicaciones: * Separar proteínas * Determinar peso molecular de una proteína * Separar proteínas oligoméricas * Separar proteínas en función de su pI * Separar proteínas de mezclas muy complejas * Ver si hay una proteína en concreto SDS-PAGE Isoelectroenfoque Electroforesis 2D Western Blot

SDS-PAGE - - Condiciones de la PAGE: * No desnaturalizantes: separamos por CARGA y TAMAÑO  PAGE * Desnaturalizantes: separamos sólo por TAMAÑO  SDS-PAGE Agentes desnaturalizantes: SDS (dodecilsulfato sódico), urea, reductores (DTT, b-mercaptoetanol)... SDS: detergente aniónico (-), dota a todas las proteínas de carga (-)  todas migrarán hacia el ánodo (+), separándose sólo por tamaño S-S - 44 kDa + SDS S-S - + SDS + DTT 25 kDa PM = 50 kDa

SDS-PAGE: determinación del peso molecular Marcadores de peso molecular: * Mezcla de diferentes proteínas pre-teñidas de las que conocemos el peso molecular. * Por comparación podemos averiguar el PM de nuestra proteína.

ISOELECTROENFOQUE * Separación de proteínas según su punto isoeléctrico (pI) pI es el valor de pH en el que la carga de la proteína = 0 si pH > pI: carga (–) si pH < pI: carga (+) * Gel de poliacrilamida (PAGE) con gradiente de pH. Proteínas migran hasta la zona del gel donde pH=pI de la proteína Prot A pI=6 Prot B pI=7 + pH 2 (ácido) - pH 10 (básico) GRADIENTE DE pH A B pH 6 pH 7 A B

ELECTROFORESIS 2D * 1ª dimensión: ISOELECTROENFOQUE  separa por pI * 2ª dimensión: SDS-PAGE  separa por PM 1ª DIMENSIÓN 2ª DIMENSIÓN

ELECTROFORESIS 2D

WESTERN BLOT * Técnica immunológica  interacción PROTEÍNA-PROTEÍNA (Ag-Ac) * Detectar en una mezcla una proteína concreta mediante el uso de anticuerpos específicos (muy sensible) 1. SDS-PAGE Electroforesis proteínas 2. Transferencia a membrana proteínas proteína interés 3. Incubación con los Anticuerpos HRP 2dario 1ario SDS-PAGE Western BLOT Todas las proteínas Proteína de interés Resultado HRP 4. Revelado proteína interés SUSTRATO PRODUCTO LUZ

WESTERN BLOT * Técnica immunológica  interacción PROTEÍNA-PROTEÍNA (Ag-Ac) * Detectar en una mezcla una proteína concreta mediante el uso de anticuerpos específicos (muy sensible). SDS-PAGE: SDS-PAGE Western BLOT Todas las proteínas Proteína de interés Resultado WESTERN BLOT:

ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS Soporte: (restrictivo) * Gel de Agarosa  moléculas grandes (0.1-60 kpb) * Gel de Poliacrilamida  moléculas pequeñas (6-2000 pb) Electroforesis horizontal (agarosa) o vertical (poliacrilamida) Separación sólo por TAMAÑO Densidad de carga igual para todas las moléculas por los grupos fosfato Ácidos nucleicos = carga (-)

ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS Aplicaciones: * Separar, identificar y purificar fragmentos de DNA o RNA * Determinar tamaño de un fragmento de DNA * Separación de cromosomas enteros * Secuenciación de DNA * Identificación de regiones de unión a proteínas * Detectar la presencia de un gen (o secuencia específica de DNA) en una muestra * Determinar si se expresa un gen específico Gel de poliacrilamida Gel de agarosa Southern Blot Northern Blot

EN GEL DE AGAROSA + - Soporte: (restrictivo) Gel de agarosa Electroforesis horizontal muestra (-) + - Campo eléctrico (DV) 1. Preparación del gel 2. Aplicación de la muestra 3. Electroforesis 4. Detección por tinción con Bromuro de Etidio (BrEt): se intercala en el DNA y al irradiarlo con luz UV emite fluorescencia

EN GEL DE AGAROSA + - Soporte: (restrictivo) Gel de agarosa Electroforesis horizontal muestra (-) + - Campo eléctrico (DV) 1. Preparación del gel 2. Aplicación de la muestra 3. Electroforesis 4. Detección por tinción con Bromuro de Etidio (BrEt): se intercala en el DNA y al irradiarlo con luz UV emite fluorescencia

SOUTHERN BLOT * Interacción DNA-DNA (hibridación por complementariedad de cadena) * Detectar en una mezcla una secuencia de DNA concreta mediante el uso de sondas de DNA específicas (muy sensible) * Detectar la presencia de un gen, etc. 1. Electroforesis en gel de agarosa moléculas de DNA 3. Hibridación con la sonda radioactiva DNA interés …ATTGCA… …TAACGT… Sonda de DNA 32P 2. Transferencia a membrana moléculas de DNA Gel Agarosa Southern BLOT Todos los DNA de interés Resultado 4. Revelado DNA interés 32P

NORTHERN BLOT * Interacción RNA-DNA (hibridación) * Detectar en una mezcla una secuencia de RNA concreta mediante el uso de sondas de DNA específicas (muy sensible) * Expresión génica 2. Transferencia a membrana moléculas de RNA Gel Agarosa Northern BLOT Todos los RNA de interés Resultado 1. Electroforesis en gel de agarosa 3. Hibridación con la sonda radioactiva interés …AUUGCA… …TAACGT… Sonda de DNA 32P 4. Revelado

Links a simulaciones de electroforesis: - En tira de acetato de celulosa: http://sebbm.bq.ub.es/BioROM/contenido/biomodel/lab/acetato/inicio.htm - En gel de poliacrilamida http://biomodel.uah.es/lab/sds-page/inicio.htm - En gel de agarosa: http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/elfo/gel_electrophoresis.swf http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/elfo/electrof.html