Cátedra Microbioloegía General FACENA – UNNE 2010 MICOBACTERIAS Cátedra Microbioloegía General FACENA – UNNE 2010

Objetivo Conocer las principales características biológicas de los BAAR, su capacidad para producir infecciones, las posibilidades diagnósticas y las medidas profilácticas

MICOBACTERIAS Orden: Actinomycetales Suborden: Corynebacterineae Familias: - Corynebacteriaceae - Nocardiaceae - Mycobacteriaceae

Caracteres generales de las micobacterias Bacilos delgados, rectos o ligeramente curvados, a veces ramificados, solos o en pequeños grupos G+ (aunque se tiñen muy mal) • Ácido-Alcohol-Resistentes, tiñen bien por Ziehl-Neelsen ( rojo sobre fondo azul) • Técnicas fluorescentes (Auramina+ Rodamina B) Inmóviles no esporulados, no capsulados carecen de fimbrias Aerobios Patógenos y saprofitos Más de 50 especies (agentes de la TB, lepra y paratuberculosis).

Taxonomía Familia Mycobacteriaceae Género Mycobacterium Especies M. tuberculosis M. bovis M. leprae Micobacterias atípicas

CLASIFICACIÓN DE LAS MICOBACTERIAS* (crecimiento lento y no cromógenas) *M. avium, M. aviumsubsp. paratuber-culosis, M. intracellulare, M. ulcerans (crecimiento lento y no cromógenas)

Mycobacterium tuberculosis R. Koch (1843-1910) (24/3/1882) ‘había observado y aislado el microorganismo que causaba la TB en el hombre y en el ganado bovino’

Género Mycobacterium Bacilos ácido-alcohol resistentes debido a la presencia de ácidos grasos en la pared. Aerobios estrictos. Pueden aparecer como saprófitos del suelo y el agua y pueden producir enfermedades La mayoría son de crecimiento lento (abundancia de lípidos dificulta el paso de nutrientes al interior de la célula).

Estructuras Pared celular fina (20 nm) La estructura de la pared celular es inusual. Incluye 4 tipos de polímeros: Peptidoglicano–Arabinogalactano–Ácidos micólicos–Lipoarabinomanano Además se incluyen lípidos de superficie (micósidos, sulfolípidos,etc.) Las micobacterias comparten la mayoría de los antígenos.

Peptidoglicano Similar al de otras bacterias (cadenas de polisacáridos -NAM + NAG-cruzadas con cortos puentes peptídicos) Unido al arabinogalactano por un único puente diglicosil-fosforil que contiene ramnosa y n-acetilglucosamina.

Ácidos micólicos Factor de virulencia. El componente principal de la envoltura (hasta 60% del peso seco de la pared) Hidrofóbicos, forman la cubierta lipídica Uniones covalentes tipo éster a una arabinosa al final del arabinogalactano ramificado Factor de virulencia. • Probablemente previenen el ataque por proteínas catiónicas, lisozima y radicales de oxígeno en la vesícula fagocítica • Inhiben la absorción de nutrientes • Causan agregación bacteriana • Contribuyen al crecimiento lento

Lipoarabinomanano Un glicolípido al final de la envoltura aunque está anclado profundamente en el peptidoglicano Estructura compleja Un núcleo de manosas unidas a múltiples cadenas laterales ramificadas de arabinofuranosil-manosa y una unidad de fosfatidilinositol que puede ser utilizada como un puente de unión a otros elementos de la envoltura

Otros Lípidos de superficie Micósidos: –Cera D: Ácido micólico+ arabinogalactano y éste a 4 NAG/NAM, a los que se unen 2 cadenas de tetrapéptidos. Una falsa cera. Propiedades adyuvantes. –Factor Cordón: 6,6,dimicolil-trealosa (2 ácidos micólicos unidos a trealosa). Asociado a la virulencia (es leucotóxico: inhibe la succinato DH, provoca el hinchamiento de las mitocondrias y separa los ribosomas del RER). •Fosfolípidos: cardiolipina, fosfatidiletanolamina y fosfatidilinositolmanósidos. Implicados en la formación de granulomas. •Sulfolípidos: glicolípidos sulfatados (ácidos grasos + trealosa); ej., sulfolípidoI. Asociados a la virulencia (actúan como fagolisosomas) •SOD (superóxidodismutasa): neutraliza la capacidad oxidante de los iones superóxido.

Factores de virulencia Factor Cordon: glicolípido (trealosa 6’,6’dimicolato) que es responsable del crecimiento serpenteante (en forma de cordón o filamento) en el que los bacilos crecen en forma cerrada y ordenada Es tóxico para los leucocitos, antiquimotáctico, interfiere con la función mitocondrial en los ratones y juega un papel importante en el desarrollo de las lesiones granulomatosas Capacidad de adquisición de hierro: requerido para la supervivencia en el interior de los fagocitos– Sulfolípidos: previenen la fusión fagosoma-lisosoma y hacen que los bacilos no estén expuestos a las enzimas lisosómicas (importante en la supervivencia intracelular)

M. tuberculosis - Patología Tuberculosis pulmonar Primoinfección: generalmente pasa desapercibida si el paciente es inmunocompetente Reinfección Tuberculosis extrapulmonar Meningitis Mastitis Pielonefritis Abscesos TBC miliar (múltiples focos infecciosos)

Diagnóstico de laboratorio Esputo, Orina, Punción de abscesos, Biopsias, etc.  Coloración de Ziehl-Neelsen (Baciloscopía) Cultivo en Lowenstein-Jensen  Incubar a 37ºC - 30 a 90 días, aerobiosis Coloración de Ziehl-Neelsen Identificación y Antibiograma (No siempre, sólo en casos especiales)

Coloración de Ziehl-Neelsen Cubrir con fucsina de Ziehl y calentar Observar al microscopio Contracolorear con azul de metileno Decolorar con alcohol + HNO3 al 3% Realizar un extendido y fijar a la llama

Baciloscopía Definición: Recuento de bacilos ácido alcohol resistentes en la muestra. Utilidad: Sirve para dar inicio al tratamiento y seguirlo. Técnica: Realizar dos extendidos con la muestra, colorear con Ziehl-Neelsen y observar al microscopio 100 campos, promediando el número de BAAR observados.

Ziehl-Neelsen/Kinyoun (1000x) Baciloscopía Ziehl-Neelsen/Kinyoun (1000x) Informe No se observan BAAR 1-9/100 campos Cuenta exacta 10-99/100 campos 1+ 1-10/campos 2+ > 10/campo 3+

tiempo de replicación 20 horas Cultivo Homogeneización y decontaminación de la muestra con NaOH. Medio de Lowenstein-Jensen Huevo (albúmina y lípidos) Verde de malaquita (inhibidor) Glicerol (fuente de carbono) Asparagina (fuente de nitrógeno) Incubar a 37ºC durante 30 a 90 días, aerobiosis Crecimiento lento: tiempo de replicación 20 horas Colonias secas, amarillentas y rugosas

Reacción de Mantoux Definición: técnica para evaluar “in vivo” la inmunidad celular frente al bacilo tuberculoso. Antígeno: derivado proteico purificado (PPD). Antiguamente se usaba la tuberculina. Utilidad: Sirve para detectar contacto previo con el bacilo tuberculoso. Técnica: inocular 0,1 ml de PPD por vía intradérmica en el antebrazo. Leer la induración a las 48-72 hs.

Interpretación Negativa Positiva Dudoso No se observa induración o induración menor a 4 mm. No existió contacto o la persona es inmunosuprimida. Hay posibilidades de infección. Positiva Induración de 10 mm o más. Hubo contacto con la bacteria o sus antígenos por vacunación Dudoso Induración de 5 a 9 mm. Puede deberse a contacto con otras micobacterias

Vacunación Vacuna con el Bacilo de Calmette y Guerin (BCG). M. bovis vivo atenuado por repiques sucesivos en papa biliada. Se aplica por vía intradérmica. Sólo se vacunan los tuberculinos negativos (PPD negativa). Vacunar durante el primer mes de vida y al ingreso escolar previa reacción de Mantoux. Previene sobre todo la meningitis tuberculosa que generalmente es mortal.

Caracteres de interés epidemiológico Muy sensible al calor: 70ºC 5’en leche Resistente a los ácidos, álcalis y muchos desinfectantes químicos (utilidad en la descontaminación de muestras) Puede eliminarse mediante una solución débil de lejía en agua (1:9) Fenol al 2% o formol al 3% 3 h son muy eficaces. Fenol al 5% muy eficaz con/sin materia orgánica Glutaraldehido al 2%, muy eficaz Etanol al 80% (10 ‘o menos): desinfección de piel y materiales de uso clínico. Con materia orgánica se reduce Oxido de etileno: moderadamente eficaz Derivados de amoniocuaternario, clorhexidina y yodóforos: relativa o totalmente ineficaces Yoduros de amoniocuaternario: muy eficaces

M. tuberculosis y M. bovis no se multiplican en el medio ambiente pero sobreviven varios meses en el suelo o estiércol bovino Resistentes a la desecación. Si se protegen de la luz solar sobreviven semanas o meses Se destruyen rápido por la luz solar o radiaciones UV (4-10 veces más sensibles que E. coli)

Mycbacterium leprae

Lepra - Definición Infección crónica que afecta piel, nervios periféricos, ojos y membranas mucosas producida por Mycbacterium leprae

Lepra - Agente etiológico Mycobacterium leprae es un bacilo ácido-alcohol resistente, no cultivable in vitro. Puede presentarse como: Elementos paralelos (paquete de cigarrillo) Masas esféricas o globis (multiplicación intensa en el interior de los macrófagos)

Patología Se denomina lepra y se conoce desde hace miles de años. La puerta de entrada es cutánea El hombre es el único reservorio El bacilo se disemina por vía linfática, hemática o neural. Se destruyen las terminales nerviosas, hay pérdida de sensibilidad y despigmentación de la piel. Existen tres tipos de lepra Tuberculoide: buena inmunidad celular. Afectación localizada. Lepromatosa: mala inmunidad celular. Afectación generalizada. Borderline: formas intermedias entre las anteriores.

Diagnóstico de laboratorio El bacilo no se cultiva. El diagnóstico se realiza por observación directa con Ziehl-Neelsen y por anatomía patológica. Se realiza un Triple BAAR, o sea se colorean con Ziehl-Neelsen tres muestras diferentes: Moco nasal Linfa de lóbulo de la oreja Linfa de la lesión Se informa el número de BAAR y la morfología

Reacción de Mitsuda Definición: técnica para evaluar “in vivo” la inmunidad celular frente al bacilo de la lepra. Antígeno: se utilizan bacilos muertos por calor denominados lepromina. Utilidad: Sirve para diferenciar los tipos de lepra en pacientes enfermos o la resistencia a ella en personas sanas, generalmente convivientes. Técnica: inocular 0,1 ml de lepromina por vía intradérmica en el antebrazo. Leer la induración a las 3 semanas.

Reacción de Mitsuda Interpretación Negativa: Positiva: Dudosa: No se observa induración. En enfermo: lepra lepromatosa En persona sana: susceptibilidad a la lepra Positiva: Induración de 3 mm o más. En enfermo: lepra tuberculoide En persona sana: resistencia a la infección. Dudosa: Induración de 1 a 2 mm. Aparece en los comienzos de la enfermedad

Epidemiología y Prevención El bacilo es eliminado por lesiones y moco nasal, siendo el hombre el único reservorio conocido. Para que exista el contagio debe haber contacto íntimo, prolongado y frecuente. Debe realizarse diagnóstico y tratamiento precoz. Debe administrarse quimioprofilaxis en contactos de pacientes leprosos. La vacuna con el Bacilo de Calmette y Guerin (BCG) produce inmunidad inespecífica para la lepra tuberculoide.

Micobacterias atípicas El laboratorio de Koch, en Wollenstein, en 1872

GRUPO I: Crecimiento lento fotocromógenas: M. kansasii, M. marinum Definición: micobacterias que producen lesiones variadas, diferentes a la tuberculosis. Producen abscesos y lesiones cutáneas en pacientes con importante compro-miso inmunitario. Clasificación (Temple y Runyon) : basada en la producción de pigmento, velocidad de crecimiento y características de las colonias GRUPO I: Crecimiento lento fotocromógenas: M. kansasii, M. marinum GRUPO II: Crecimiento lento escotocromógenas: M. gordonae, M. xenopi GRUPO III: Crecimiento lento no cromógenas: M. avium-intracellulare GRUPO IV: Crecimiento rápido: M. fortuitum, M. chelonei

Diagnóstico de laboratorio Esputo, Orina, Punción de abscesos, Biopsias, etc.  Coloración de Ziehl-Neelsen Cultivo en Lowenstein-Jensen  Incubar a 37ºC 4 a 90 días Pruebas bioquímicas Antibiograma

BIBLIOGRAFÍA Basualdo J. A. y cols. Microbiología Biomédica. Ed. Atlante. Segunda Edición. Año 2006. Sherris. Microbiología Médica. Ryan K. J., Ray C. G. Editorial Mc Graw Hill. 4ta. Edición. Año 2005. TUBERCULOSIS BOVINA. EL AGENTE. Elías F. Rodríguez Ferri. Universidad de León. Pumarola A. y cols. Microbiología y Parasitología Médica. Ed. Masson-Salvat Medicina. Segunda Edición. Año 1987.