SESIÓN DE APRENDIZAJE N°3 PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS EN LEVADURAS. Transformación de Saccharomyces cerevisiae. Sistemas de vectores en levaduras Producción de proteínas Cantidad de proteína producida Uso de levaduras no convencionales (recombinación homóloga, sistemas inducibles) Perspectivas futuras. 27/09/2016 Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia

09/26/11copyright All Rights Reserved. 2 El explosivo desarrollo de la producción de aditivos alimentarios no tradicionales a nivel mundial en los últimos años, ha establecido un importante mercado internacional que alcanza un nivel de operaciones de orden de los miles de millones de dólares anualmente. Esta envergadura comercial es atribuible a diferentes factores entre los que se encuentran la factibilidad de procesamiento de los alimentos en el hogar o centros de consumo colectivo, la necesidad de aumentar la estabilidad de los alimentos en el almacén o en la vidriera de ventas, la satisfacción de necesidades de índole dietética como es el bajo contenido de colesterol entre otros, la disminución de los costos de producción y la suplementación de nutrientes en programas de alimentación masiva subsidiados para sectores de bajos ingresos etc. 27/09/2016 Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia

09/26/11copyright All Rights Reserved. 3 La biomasa microbiana, y en particular la de las levaduras, es una fuente de productos de interés alimentario conocida básicamente por su capacidad de generar CO 2 en las industrias panadera y de bebida alcohólicas. Se ha utilizado de forma importante en la producción de extractos como saborizantes lo que compone su segundo uso mayoritario. Sin embargo, la biomasa de levadura es a un mismo tiempo, una fuente interesante de muchos compuestos de interés alimentario y farmacéutico. Entre los componentes de mayor atractivo se encuentran los polisacáridos y las proteínas, que constituyen entre ambos, más del 70% del peso seco de la célula. 27/09/2016 Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia

09/26/11copyright All Rights Reserved. 4 Las proteínas como ingredientes alimentarios, han sido objeto de numerosas investigaciones, dadas sus propiedades funcionales, especialmente las derivadas de la soja que están ampliamente extendidas en la industria alimenticia actual. Los contenidos de proteínas de las levaduras de recuperación de cerveza son superiores a 50% con un perfil de aminoácidos en éstas, comparable a la de la soja y otras fuentes de origen vegetal, es un recurso existente en la mayoría de los países de nuestra región. Latinoamérica produjo en 1994, más de 12 mil millones de litros de cerveza de los que se derivan alrededor de 20 mil toneladas anuales de proteínas que actualmente se emplean en la producción de saborizantes y en la alimentación animal básicamente. 27/09/2016Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia

Es un microorganismo de uso industrial debe producir la sustancia de interés; debe estar disponible en cultivo puro; debe ser genéticamente estable y debe crecer en cultivos a gran escala. Otra característica importante es que el microorganismo industrial crezca rápidamente y produzca el producto deseado en un corto período de tiempo. La levadura que sin duda fue la primera y aún hoy en día sigue siendo la más utilizada por el hombre es Saccharomyces cerevisiae de la que se emplean diferentes cepas para la fabricación de cerveza, vino, pan y alcoholes industriales

* Hongos microscópicos unicelulares * Importantes por su capacidad de fermentación * Produciendo distintas sustancias. * Las levaduras son abundantes en la naturaleza * Se encuentran en el suelo y sobre las plantas * Hongo perteneciente al phylum Ascomycota. * Su reproducción se da por gemación.

DEFINICION Se denomina levadura a cualquiera de los diversos hongos microscópicos unicelulares que son importantes por su capacidad para realizar la descomposición mediante fermentación de diversos cuerpos orgánicos, principalmente los azúcares o hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias. hongos unicelulares fermentaciónhidratos de carbono

La mayoría de las levaduras son hongos unicelulares sencillos microscópicos, la mayoría se reproducen asexualmente por gemación, y otras especies lo hacen por fisión múltiple.

La mayoría de las colonias jóvenes de levaduras son húmedas y algo mucosas, y es posible que tengan aspecto harinoso. La mayoría de las colonias son blanquecinas, algunas tienen un color crema o rosado

TIPOS DE REPRODUCCIÓN  a. Gemación: Proceso asexual, en el cual la célula progenitora reparte sus constituyentes celulares con una célula hija (sin división del núcleo); las dos células son iguales en su madurez.

b. Esporulación  Proceso de reproducción sexual; en el ciclo sexual, una célula diploide normal da lugar a dos ascas o células esporogéneas, que contienen cuatro ascosporas haploides.

c. Fisión  Reproducción vegetativa o asexual, semejante al proceso reproductor de las bacterias. Las células aumentan de tamaño y se alargan, el núcleo se divide y se originan dos células semejantes.

FERMENTACION El término fermentación, en su acepción estricta, se refiere a la obtención de energía en ausencia de oxígeno y generalmente lleva agregado el nombre del producto final de la reacción.

Productos de la microbiología Industrial

Saccharomyces cerevisiae Panificacion, cerveza, vinos, bebidas destiladas, etanol, sidra, levadura para alimentacion humana y animal, sub-productos de levadura (autolisados, hidrolizados, proteinas, componentes: aa, vitaminas, invertasa, etc) Saccharomyces cerevisiae Panificacion, cerveza, vinos, bebidas destiladas, etanol, sidra, levadura para alimentacion humana y animal, sub-productos de levadura (autolisados, hidrolizados, proteinas, componentes: aa, vitaminas, invertasa, etc) Saccharomyces uvarum: cerveza Saccharomyces uvarum: cerveza Saccharomyces sake sake (Vino oriental) Saccharomyces sake sake (Vino oriental) Saccharomyces bayanus Vinos burbujeantes Saccharomyces bayanus Vinos burbujeantes Saccharomyces lactis lactasa Saccharomyces lactis lactasa

S. cerevisiae es uno de los modelos más adecuados para el estudio de problemas biológicos. Es un sistema eucariota, con una complejidad sólo ligeramente superior a la de la bacteria pero que comparte con ella muchas de sus ventajas técnicas. Es utilizada para la elaboración de pan, cerveza y vino. Además de su rápido crecimiento, la dispersión de las células y la facilidad con que se replican cultivos y aíslan mutantes, destaca por un sencillo y versátil sistema de transformación de ADN. Por otro lado, la ausencia de patogenicidad permite su manipulación con las mínimas precauciones. 09/26/11copyright All Rights Reserved. 18 Saccharomyces cerevisiae 27/09/2016Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia

Una de las levaduras más conocidas es la especie (Saccharomyces cerevisiae). Esta levadura tiene la facultad de crecer en forma anaerobia realizando fermentación alcohólica. La levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C.Hansen) es un hongo unicelular, un tipo de levadura utilizado industrialmente en la fabricación de pan, cerveza y vino. El ciclo de vida de las levaduras alterna dos formas, una haploide y otra diploide. Ambas formas se reproducen de forma asexual por gemación. En condiciones muy determinadas la forma diploide es capaz de reproducirse sexualmente. En estos casos se produce la meiosis en la célula formándose un asca que contiene cuatro ascosporas haploides.

Una ventaja adicional de este microorganismo consiste en que se conoce la secuencia completa de su genoma y se mantiene en constante revisión Las utilidades industriales más importantes de esta levadura son la producción de cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y etanol durante el proceso de fermentación

Proteína quinasa codificada por el gen CDC28 del Saccharomyces cerevisiae y necesaria para la progresión desde la FASE G1 a la FASE S del CICLO CELULAR. Miembro de la familia Rho de PROTEINAS DE UNIÓN AL GTP MONOMÉRICAS, de SACCHAROMYCES CEREVISIAE. Interviene en acontecimientos morfológicos relacionados con el ciclo celular.

27/09/2016 Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia Ciclo sexual de Saccharomyces cerevisiae Haploide Diploide permite generar, aislar y caracterizar mutantes con mucha facilidad se pueden realizar estudios de complementación

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Rutinariamente se han introducido genes de eucariotas superiores en levaduras para el análisis sistemático de su función. Por estas razones, S. cerevisiae se ha convertido en una Importante herramienta a gran escala de de genómica funcional, proporcionando un punto de partida para el análisis de organismos eucariotas más complejos. Al ser un organismo unicelular con una tasa de crecimiento rápida, la levadura se puede utilizar para los estudios de células que resultarían muy complicados o costosos en organismos multicelulares. 09/26/11copyright All Rights Reserved /09/2016Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia

27/09/2016 Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia Desde el punto de vista científico, este microorganismo se ha empleado como modelo simple de la célula eucariota. Esto se debe a una serie de ventajas como su facilidad de cultivo y su velocidad de división celular (aproximadamente dos horas).

Las fuentes de carbono utilizadas por las levaduras varían desde los carbohidratos hasta los aminoácidos. Además, la capacidad de utilizar ciertos tipos de azúcares ha sido tradicionalmente empleada para la caracterización de las distintas razas que esta especie presenta. 09/26/11copyright All Rights Reserved. 26 Nutrición de S. cerevisiae 27/09/2016Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia

27/09/2016Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia Utilidades industriales producción de cerveza, pan y vino gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y etanol durante el proceso de fermentación.

27/09/2016Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia Azúcares que se pueden utilizar para la fermentación: Monosacáridos como la glucosa, fructosa, manosa y galactosa, entre otros. disacáridos como la maltosa y la sacarosa trisacáridos como la rafinosa Uno de los azúcares que no puede metabolizar es la lactosa, utilizándose este azúcar para distinguir esta especie de Kluyveromyces lactis También es capaz de utilizar otras fuentes de carbono distintas a carbohidratos y aminoácidos. Entre las más destacadas se encuentra la capacidad de utilizar tanto etanol como glicerol.

27/09/2016 Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia FERMENTACION ALCOHOLICA Dos reacciones sucesivas: piruvato > acetaldehido + CO2 acetaldehido + NADH +H > etanol + NAD+

27/09/2016Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia C6H12O6 + 2 Pi + 2 ADP → 2 CH3-CH2OH + 2 CO2 + 2 ATP kcal

No obstante, la gran mayoría de los organismos son muy sensibles al etanol, por lo que se ha entendido como un proceso de competencia por sustrato. Las levaduras, además de necesitar una fuente de carbono, necesitan tanto fuentes de nitrógeno como podrían ser el amonio, la urea o distintos tipos de aminoácidos— como fuentes de fósforo. Además, son necesarias vitaminas como la Biotina, también traza. llamada Vitamina H, y distintos elementos traza. 09/26/11copyright All Rights Reserved /09/2016Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia

Genoma de S. cerevisiae El genoma de esta levadura contiene un conjunto de dieciséis cromosomas completamente caracterizados. Sus tamaños oscilan desde 200 a kb. Se calcula que aproximadamente debe contener unos 6200 marcos abiertos de lectura, o genes. Patogenia Saccharomyces cerevisiae no se considera un patógeno común. Actualmente cobra importancia su papel oportunista en sepsis en enfermos de leucemia y otras infecciones oportunistas en enfermos de sida. 09/26/11copyright All Rights Reserved /09/2016Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia

VECTORES DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS EN S. cerevisiae. El vector de expresión es uno de los aspectos que ha recibido una mayor atención en el campo de la expresión de proteínas heterólogas, existiendo en la actualidad un amplísimo número de vectores de diferentes características que permiten llevar a cabo la expresión de una proteína de la forma más adecuada en cada caso. En el desarrollo de un vector de expresión son varios los factores a tener en cuenta para su diseño: El tipo de promotor y de terminador Las modificaciones en el gen heterólogo y Por último la estabilidad del vector en la célula. 09/26/11copyright All Rights Reserved /09/2016Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia

Sistemas de promotores. Tras la descripción de los sistemas de transformación de S. cerevisiae se iniciaron rápidamente los estudios sobre la expresión de genes heterólogos. Los primeros intentos se realizaron empleando los promotores de la proteína (secuencia especial de bases en el ADN que es reconocida por las ADN polimersas. El promotor indica a la ADN polimerasa el lugar donde comienza la transcripción de un gen) ; esto causaba fallos en la iniciación de la transcripción dando lugar a moléculas de mRNA aberrantes. 09/26/11copyright All Rights Reserved /09/2016Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia

Un ejemplo lo representa el primer intento de producción de una proteína heteróloga, la β-globina de conejo. Tras esta observación se llegó a la conclusión acerca de la necesidad de emplear promotores de levadura para dirigir la transcripción de los genes heterólogos. Siendo el primer ejemplo de proteína heteróloga producida de forma eficiente en S. cerevisiae, la producción de alfa interferón bajo el promotor de la alcohol deshidrogenasa 1. Los promotores para dirigir la expresión de proteínas heterólogas deben de ser unos promotores fuertes, es decir pertenecientes a genes de la levadura con un alto nivel de expresión. 09/26/11copyright All Rights Reserved /09/2016Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia

Las características de los promotores de levadura, así como los factores que regulan la eficiencia y el inicio de la transcripción son ampliamente descritos por Struhl (1989). En un primer momento se centraron los esfuerzos en el aislamiento de promotores de genes de la ruta glicolitica. Ya que eran genes de un alto nivel de expresión; más adelante se comprobó la necesidad de regular la expresión por lo que se buscaron promotores de expresión regulable. Recientemente se han desarrollado promotores híbridos que combinan varias características de los anteriores. Promotores de la ruta glicolítica. Promotores regulables. Promotores híbridos. 09/26/11copyright All Rights Reserved /09/2016Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia

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Ejemplos de proteínas heterólogas de interés expresadas en S. cerevisiae. 09/26/11copyright All Rights Reserved /09/2016Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia

Producción de biomasa celular (PRODUCCIÓN DE LEVADURA DE PANIFICACION) Existe la evidencia de que el pan era conocido alrededor del año 2600 a.C. en Babilonia, y ya en el siglo 12 a.C. era producido normalmente con una tecnología establecida. Lógicamente esto implica que el hombre dominaba ya el uso de la levadura para levar la masa preparada con harina y producir así el pan. En las primeras épocas se utilizaba la levadura obtenida de la fabricación de cerveza primero y de las destilerías después, hasta que finalmente se establecieron las plantas de producción de levadura durante el siglo /26/11copyright All Rights Reserved /09/2016Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia

Inicialmente fue la levadura de cerveza, el Saccharomyces uvarum, syn S. carlsbergensis, el empleado con fines de panificación. Posteriormente se la reemplazó por la levadura de las destilerías, y por la llamada levadura de panificación, que es el Saccharomyces cerevisiae. Se han ensayado también muchas otras cepas, no sólo del mismo género sino también las pertenecientes a distintas especies de Candida, Hansenula y Zygosaccharomyces, aunque ninguna de ellas demostró poseer ventajas sobre el Saccharomyces cerevisiae. Las propiedades fundamentales son aquellas relacionadas con la producción, que resultan en un crecimiento rápido y altos rendimientos a partir de las melazas con el mantenimiento de las propiedades de panificación exigidas, que son el poder fermentativo y la estabilidad del producto. 09/26/11copyright All Rights Reserved /09/2016Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia

Estas propiedades dependen de muchos genes que intervienen en los ciclos de la glicolisis y de los ácidos tricarboxilicos, como así también en el metabolismo del nitrógeno y en la síntesis de hidratos de carbono de reserva. Algunas cepas de interés industrial se han obtenido utilizando técnicas de hibridación. La obtención de híbridos para mejorar una cepa no es siempre exitosa, ya que los productos de fusión (híbridos) tienen que cumplir con todas las características exigidas por las levaduras comerciales. 09/26/11copyright All Rights Reserved /09/2016Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia

Las técnicas de ingeniería genética han abierto una nueva área de interés industrial en el campo de las levaduras. Sin embargo, hasta el presente esas técnicas no han sido de utilidad en la industria de la levadura de panificación, porque los logros alcanzados incluyen solamente propiedades bioquímicas relacionadas con pocos genes. Las cepas de levadura que han sido desarrolladas en los últimos años, permiten la producción de productos de interés farmacológico como la insulina, hormona de crecimiento bovina, interferón, vacuna contra la hepatitis B, se han originado en cepas de laboratorio definidas genéticamente y no en cepas de levaduras industriales. 09/26/11copyright All Rights Reserved /09/2016Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia

GRACIAS 09/26/11copyright All Rights Reserved /09/2016 Mg. Q.F. Jéssica N. Bardales Valdivia