MICROBIOLOGÍA & HIGIENE Jean-Pierre VALADE Noviembre 2005

Higiene de la línea de vino Qué es la Higiene? « Todos los cuidados para garantizar la inocuidad, el buen estado de salubridad de los alimentos en todos los estados, después de la cosecha, la producción o la fabricación,hasta el consumidor final. » Noción de calidad higiénica: respecto de la salud Noción de calidad productiva: evitar las alteraciones. COnocimientos empíricos de higiéne: Ejemplo = Bebidas fermentadas.

Microbiología de la línea de vinos Microorganismos del vino Interés tecnológico Responsable de alteraciones Predominan la flora y sus actividades, técnicas de vinificación Elementos donde predomina la higiene

Microbiología de la línea de vinos Etimología (en griego): Mikros = pequeños bios = vida logos = ciencia La microbiologia es el ensamble de disciplinas biológicas dedicadas al estudio de microorganismos.

Microbiología del vino Los principales gérmenes encontrados en la enología Los mohos, presentes sobre los racimos y en las cavas. Ellos no son jamás útiles y pueden provocar malos sabores. Hongos filamentosos uni o multicelulares Organismos eucaryotes aeróbios Gran capacidad de diséminación

Microbiología del vino Los mohos: posibles alteraciones - Producción de 2,4,6 Tricloroanisol Olor a tierra, corcho enmohecido Mycotoxinas: achratoxina A Cancerígeno Análisis por sondeo Norma europea

Microbiología del vino Los principales gérmenes encontrados en la enología Las levaduras, responsables de la fermentación alcohólica, más tambien da alteracioens(« flor », fermentación en botellas). - Celula eucaryota hongo unicelular Reproducción por gemación o scissiparidad Tamaño 5 à 20 µm

Microbiología del vino Las levaduras: alteraciones posibles Durante la FA  olores desagradables H2S, acidez acética, fenoles volátiles  Carbamatos de etilo Durante el almacenamiento  Velos sobre la superficie  Refermentación en botellas

Microbiología del vino Los principales gérmenes encontrados en la enología Las levaduras del género Brettanomyces, dan origen a alteraciones de tipo aromáticas y gustos animales - Célula eucaryota Hongo unicelular Reproducción por gemación Tamaño 2 à 20 µm

Microbiología del vino Las levaduras del género Brettanomyces: alteraciones posibles Fenoles volátiles  Etil-4-fenol (E4P)  Etil-4-Gaïacol (E4G) Descriptores varios: Animal, cuero, sudor de caballo, establo, aguado,…

Microbiología del vino Los principales gérmenes encontrados en la enología Las bacterias lácticas, agentes de la fermentación maloláctica, más causa enfermedades(picadura láctica, tourne, grasa). - Célula procaryota es Gram + Forma « cocoo » o « bastón » Metabolismo anaerobio Tamaño del orden del µm

Microbiologie du vin - La enfermedad de la grasa Picadura láctica Las bacterias lácticas: posibles alteraciones - La enfermedad de la grasa Picadura láctica Degradación del ácido tartárico (tourne) Degradación del glicérol (amertume) Degradación del ácido sórbico (olor a geranio) Gusto a ratón Aminas biógenas

Microbiología del vino Los principales gérmenes presentes en la enología Las bacterias acéticas, efectos nefastos, responsables de la picadura acética. Célula procaryota es Gram - Forma « coccobacilo » Métabolismo aerobio estricto Tamaño del orden del µm

Microbiología del vino Las bacterias acéticas: posibles alteraciones -Picadura acética: producción de acidez acética  Etanol se transforma en ácido acético + acetato de etilo

Microbiología del vino Tipo de microorganismo Desviación observada Factores de riesgo Brettanomyces Fenoles volátiles Azúcares reciduales >3g/L T°C elevadas >15°C SO2 libre<25mg/L Falta de calrificación o filtración Higiene insuficiente pH elevado Pediococcus Enfermedad de la grasa Bacterias acéticas Picadura acética

Evolución de la población de: Microbiología del vino Evolución de la población de: Agregado de SO2 Agregado de Lysozima Aireación Anaerobiosis Levaduras - ++ Bacterias Lácticas -- --- + Bacterias acéticas +++ +: acción favorable; -: acción desfavorable

Higiene en la vendimia Azúcares + humedad+ aire + calor + aucencia SO2 Todos los microorganismos pueden desarrollarse Precauciones a tener en cuenta  Reducir el tiempo de transporte de las uvas  Limitar el aplastamiento de las uvas  Sulfitar el zumo liberado  Protección por iniertización (N2, CO2, frío)

Recepoción en la cuba Azúcares + humedad+ aire + calor + aucencia SO2 Todos los microorganismos pueden desarrollarse Higiene crusial más dificil Estudiar el sulfitado Sulfitado = f(higiene) Sulfitar lo más pronto posible(se aconseja= 6 g/hL)

Fermentación? Levaduras indígenas Fermentación  Sin Manejo del conjunto de condiciones  Manejo del conjunto de condiciones Levaduras indígenas Fermentación Riesgos de cepas nefastas Desviaciones organolépticas Ejemplo: Brettanomyces

Fermentación Interés  Finalización rápida de la FA, evita crecimiento de flora« indesiable »; manejo de la cinética de la fermentación  FA completa y producto estable  Evitar crecimiento de alteraciones del tipo falsos gustos o el desarrollo de compuestos del tipo carbamato de etilo

Fermentación  Fermentar lo antes posible  Fermentar TODAS las cubas con siembra de cepas seleccionadas  Trabajar en buenas concidiones de higiene  SO2 libre cercano a 0  T°C: evitar los fríos y los choque térmicos

Fermentación Eficacia de la fermentación en función de la HIGIENE de la Bodega Reporte de la siembra Levaduras indígenas por ml Levures aportadas por ml Implatación exitosa Buena Higiene 10 000 1 000 000 a 3 000 000 FA asegurada en 99,9% por levaduras aportadas Higiene media 3 000 000 a 5 000 000 FA asegurada en 50/50 por lev.indígenas y LSA Higiene deficiente 30 000 000 a 50 000 000 FA asegurada en 80/90% por lev indígenas 100 1 0,1

Fin de fermentación alcohólica Si no se desea realizar fermentación maloláctica  Limpiar al vino  Airear el vino  Sulfitar en 3-4 g/hL, regular según el pH, el TAV y los niveles de población microbiana  Dejar bajar la temperatura por debajo de los 15°C

Pediococcus et lactobacillus Siembra Bacteriana  En el arranque de la FML controlar la cinética fermentativa manejos: permet une « mise au propre » rapide des vins  Evita el desarrollo de Flora indígenay de problemáticas del tipo grasa, limitación en los tenores de aminas biógenas (Histaminas…) Pediococcus et lactobacillus

Chute de population en germes par millilitres Maîtrise des techniques avant mise Chute de population en germes par millilitres Traitement Levures Bactéries Soutirage 102 Filtration Kieselguhr Terre blanche 102 à 103 Population très peu réduite Collage sur vin rouge après FML 103 Filtration Kieselguhr Terre rose Centrifugation 103 à 104 Flash Pasteurisation 105 à 106 Brugirard & Rochard: 1991

Mise en Bouteilles Moins de 0,1 germe vivant par mL Norme très stricte parfois exigée à l’exportation Moins de 2 germes vivants par mL Bonne mise en bouteilles pour le marché intérieur et l’exportation De 2 à 100 fermes vivants par mL Acceptable dans le cadre d’un circuit de commercialisation court De 100 à 10 000 germes vivants par mL Vin limpide à brillant instable. Risque important d’altération microbienne Normes usuelles de stabilité biologique pour un vin sec embouteillé

Micro-organismes du vin Pour se développer, un germe a besoin:  Température  Substrat  Humidité  pH  Temps

(nécessite un rinçage abondant) Choix des produits En fonction des supports Matériel Produits utilisables Produits à proscrire Inox Alcalins forts Ammonium quaternaires Alcalins chlorés Acide péracétique Acides forts Alcool 70° Eau de Javel Acide chlorhydrique Produits abrasifs Béton Péroxyde + Alcalin Acide Péracétique Ammoniums quaternaires (rinçage) Haute pression Bois (nécessite un rinçage abondant) SO2 Alcalins Permanganate milieu acide Ammoniums quaternaires Produits chlorés

Choix des produits En fonction des micro-organismes Bactéries lactiques Gram + Bactéries acétiques Gram - Levures Moisissures Composés chlorés + + + Eau oxygénée Acide Péracétique Ammoniums quaternaires

Brettanomyces Que es la Brettanomyces? Levadura de alteracion frecuente Produccion de fenoles volatiles Contribuye a la complegidad aromatical Despues de una cierta concentracion el vino se torna desagradable para la mayoria de la gente

Brettanomyces  Bodega (valvulas, alcantarillas, madera) Ecologia  Bodega (valvulas, alcantarillas, madera) Equipamientos (matérial vitivinicolas, bombas) Caracteristicas morfologicas Polimorfo; Tamaňo pequeño: 2 a 6,5 µm Filtración - Porosidad

Brettanomyces  Produccion de acido acetico a partir del azucar Fisiologia  Produccion de acido acetico a partir del azucar  Produccion de acetato de etilo  Produccion de fenoles volatiles  Fermentacion de cellobiosa (barricas)  Produccion de acidos grassos (octa-, deca- y dodécanoico)  Capacidad de sobrevivir a concentraciones de etanol > 13% y a temperaturas > 30°C

Brettanomyces Condiciones de riesgo  Azucar residual > 3 g/L  T°C elevada > 15°C  SO2 libre < 25 mg/L  Ausencia de clarificacion y filtracion  pH elevado  Higiene insuficiente Medio de control: Higiene, SO2

Brettanomyces Proportions vins rouges: fenoles Volatiles 1 E4P/8-10 E4G Proportions vins blancs: 1 E4P/4 E4G fenoles Volatiles Etil-4-Fenol (E4P) Etil-4-Gaiacol (E4G) Descriptores variados: Animal, cuero, sudor de caballo, establo, tinta

Brettanomyces Phénols Volatils Acides Phénol & Tartrique Estérifiés Vinyls Phénol Phénol Volatils Cinnamyl-estérase Cinnamate décarboxylase Vinyl-Phénol Réductase Ethyl-4-Phénol & Ethyl-4-Gaïacol Acides coumariques & férulique Saccharomyces Brettanomyces Notes pharmaceutiques épicées Notes animales, encre

Loureiro & Malfeito-Ferreira, 2003 Brettanomyces Nivel de percepcion de l’Etil-4-Fenol Nivel de percepcion autor 450 µg/L Chatonnet et al., 1995 420 µg/L Ribéreau-Gayon et al., 1998 620 µg/L Loureiro & Malfeito-Ferreira, 2003

Brettanomyces: intérêts suivi en caves Témoin 0,35g/L Glc; SO2 14mg/L; pH 3,75; EtOH: 13,5° Saturation 02 6mg/L Oxygène 10 mL/L/mois Oxygène+Glucose 10mL/L/mois + 2 g/L Glucose Glucose 2g/L Glucose Brettanomyces (million UFC/mL) Temps (jours) Résultats Oenodev 2003

Brettanomyces: interes de la concentracion en bodega Testigo Saturacion Oxigeno Oxigeno + Glucosa Glucosa Etil Gaiacol (µg/L) 260 250 240 400 440 Etil Fenol it (µg/L 1590 1700 1580 3090 4070

Brettanomyces: intérêts suivi en caves

Brettanomyces: Données Inter Rhône Programme « Microflores d’altération » 3 vins/ 31: présence de Btrettanomyces intermedius Observatoire Qualité 8 vins sur 13 jugés « animal »: éthyl phénols Audits Techniques Brettanomyces Vin en cuve Sulfitage Vin en cuve 14100 Brett/mL 3 Brett/100mL SO2 libre = 29 mg/L

Brettanomyces: Toutes les régions Bourgogne: travaux de Vincent Gerbaux 167 Souches 35 Souches productrices de phénols Levures isolées volatils. Brettanomyces intermedius  Phénols volatils: altèrent le caractère fruité des vins au profit de caractères animaux  Contamination artificielle: capacité des Brettanomyces à se développer très rapidement.

Brettanomyces: Toutes les régions Bourgogne: travaux de Vincent Gerbaux  Phénols volatils = f(alcool; T°C; sucres)  Peu d’influence du pH  Vin avant FML est plus sensible qu’après FML  20 mg/L SO2 = pas d’effet sur les Brettanomyces  40 mg/L SO2 = effet létal sur les Brettanomyces

Brettanomyces: Todas las regiones Bordeaux: travaux d’Aline Lonvaud Barricas  Mayoria de levadura en suspencion = Saccharomyces cerevisiae  Mayoria de levaduras dentro las lias = Brettanomyces bruxellensis  Produccion importante de fenoles volatiles dentro de un vino con lias / testigo: Vin Testigo Vin + lias E4P g/L 67 5060 E4G g/L 15 890

Mise en place d’un jury de dégustation Brettanomyces: Actions prévues Outils Inter Rhône: - Dosage des phénols volatils (méthode twister) - Numération Brettanomyces (en 7 jours)  Possibilité de réaliser des expertises « Brettanomyces » Mise en place d’un jury de dégustation

Plus il y a d’ATP, plus la production de lumière est intense (URL) Diagnostic d’hygiène Plus il y a d’ATP, plus la production de lumière est intense (URL) RLU ATP + luciférine luciférase AMP + luciférine-luciférase + 1 photon

Diagnostic d’hygiène Point de contrôle Avant nettoyage Après nettoyage Bon Moyen Mauvais Cuve de tirage Arrivée du vin 683 89 Paroi 574 50 Couvercle 494 114 Matériel vinaire Fond de cuve 39 Vanne de fond 9718 1204 Paroi latérale 48 40 Manche (Ø 50) 81841 5164

Epifluorescence: Applications Dénombrement précis des levures et bactéries viables pour des FA languissantes & déviantes Dénombrement des bactéries vaibles – FML tardives ou languissantes Montée en volatile: évaluation du risque biologique Contrôle microbiologique avant mise: détermination du parcours de filtration

Microscope avec dispositif amplification de lumière Epifluorescence: Méthode Échantillon de vin Filtration Filtre Marquage 1H30 Microscope avec dispositif amplification de lumière Tampon de marquage

Conclusion Maîtrise de la microbiologie à toutes les étapes Hygiène adaptée: bonne élaboration du vin Outils de validation de l’hygiène et de contrôle microbiologique