Facultad de Ciencias Medicas BIOLOGIA MOLECULAR II Tecnología recombinante del ADN Nathaly Segura Kenneth Mazacon Yamiley Au- hing

HIBRIDACIÓN Es uno de los mecanismos en el que se produce por el cruce reproductivo entre dos especies distintas, lo cual puede producir individuos que pueden ser fértiles o no. Se basa en cambios de temperatura para desnaturalizar el adn

Se llevan a cabo dos tipos diferentes de hibridación: Tipo Southern, para uniones ADN-ADN y tipo Northern blot, para uniones ADN-ARN La cadena de doble hélice(ADN) se separa por calor. Esto rompe los enlaces de puente de hidrógeno que las mantienen unidas. Las dos hebras complementarias se separan, el ADN se desnaturaliza. Una muestra de cadenas simples se mezcla con otra igual. La muestra combinada se enfría lentamente, las moléculas sencillas se van emparejando se hacen estables termodinámicamente y se va formando una nueva molécula hibridada

Principios básicos del ensayo de hibridación Para que la hibridación permita identificar en un genoma, u otra muestra de acido nucleico se requieren dos elementos básicos: La presencia de la secuencia diana en uno de sus fragmentos Un fragmento corto de acido nucleico o sonda de secuencia conocía y complementaria a la secuencia diana.

Influencia de algunos factores sobre la hibridación Existen una serie de parámetros que afectan a la posibilidad de la re naturalización y por lo tanto condicionan la realización de un ensayo de hibridación. Estos factores están relacionados con: La condensación de DNA o RNA diana La concentración y tamaño de la sonda La temperatura y tiempo de hibridación Y características del medio de reacción tales como fuerza iónica, pH, concentración de agentes desnaturalizantes.

Rigor de hibridación Es el grado de especificidad en el apareamiento conseguido en los híbridos; capacidad de reconocimiento mutuo de dos secuencias. Con el fin de detectar que el DNA. El rigor depende de diversos factores experimentales: Tiempo y temperatura de re naturalización Longitud y concentración de las cadenas Composición de bases y ambiente químico

Métodos de ensayo de hibridación

Hibridación en fase liquida Hibridación en soporte solido Los ensayos de hibridación se pueden clasificar en tres grupos: Hibridación en fase liquida Hibridación en soporte solido Hibridación in situ

Hibridación en fase liquida Este fue el método inicialmente empleado. Utilizando una muestra de DNA o RNA, se realiza su hibridación con la sonda, al estar disueltas, la cinética es mas rápida. Por lo que la técnica es mas cuantitativa que la hibridación en solido. Es el método menos utilizado actualmente, habiendo sido reemplazado por otros mas convenientes, empleando nucleasa 51.

Hibridación en soporte solido Se trata de un tipo de ensayo mas simple que permite procesar varias muestras simultáneamente y facilita el control de la hibridación. Se lo utiliza mucho mas que la hibridación en disolución por ser mas sencillo y mas versátil. Estos métodos han adquirido un interés particular como herramienta muy validas para el análisis de ácidos nucleicos y el diagnostico de enfermedades moleculares con base genética.

Hibridación “dot-blot” y “slot-blot” Es el método mas simple y común, gracias a su posibilidad de empleo con muestra de acido nucleicos sin purificar. La muestra se aplica gota a gota o en una mancha alargada, sobre un filtro de nylon o nitrocelulasa, cuyas propiedades de adsorción fijan las moléculas de acido nucleicos y proteinas

Hibridación de Southern Es una técnica simple y fácil de realizar. El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados por tamaños mediante una electroforesis en un gel. Se realiza tinción con bromuro de etidio para comprobar la calidad de la electroforesis y del ADN. A continuación los fragmentos de ADN de doble cadena son parcialmente hidrolizados con un ácido débil y desnaturalizado para permitir la transferencia. Posteriormente, el ADN es transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro queda representada una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel. A continuación el filtro se incuba durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo); durante la incubación la sonda se va hibridando a las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una película sensible a la luz, para el caso de sondas con fluorocromo.

Hibridación northern Es esencialmente idéntica al método de Southern blot, salvo que las moléculas de ácido nucleico de la muestra, en este caso de ARN (total, mensajero, vírico, etc.), se separan por electroforesis en condiciones desnaturalizante. Esto es debido a que, a pesar de ser una molécula de una sola cadena, se forman complejas estructuras secundarias que dificultan la migración. Al igual que en el Southern blot, el ARN se transfiere a la membrana de filtro y se hibridan con sondas de ADN marcada. Durante la electroforesis se pueden observan grandes cantidades de ARNm correspondiente a ribosomal. Tanto la técnica de Southern como de Northern blot se usan poco hoy en día al haber sido sustituidas por técnicas derivadas de la PCR

Hidridación in situ Es un tipo generalizado de hibridación en soporte sólido, en la que la sonda se aplica sobre muestras e su ubicación natural, generalmente aquellas preparadas para microscopia. Supone el empleo de la hibridación bajo un abordaje citológico e histológico. Se la puede dividir según sus aplicaciones en: Hidratación in situ tisular Hidratación in situ cromosómica

Hibridación in situ tisular se realiza directamente sobre tejido, células o cromosomas localizados sobre un soporte sólido, habitualmente un portaobjetos. La visualización puede realizarse por medios isotópicos , enzimáticos o con fluorescencia , siendo evaluada en un microscopio. Su gran virtud es que permite identificar las células donde se produce la hibridación que detecta la alteración genómica o transcripcional. La visualización de resultados puede realizarse por marcaje con fluorescencia de la sonda (FISH) o cromogénico (CISH, SISH). Este último tiene la ventaja de poder realizarse en microscopio de campo claro y poder almacenarse casi indefinidamente las preparaciones(Fig. 5). Los usos más frecuentes en Patología molecular son la detección de amplificaciones (Ej. Her2 en cáncer de mama c-myc en linfoma de Burkitt), traslocaciones ( linfoma folicular, linfoma del manto, sarcomas) y presencia de virus (Epstein- Barr, HPV).

Hibridacion in situ cromosomico Es una técnica molecular que permite localizar un determinado fragmento de la secuencia de los ácidos nucleicos y pone de manifiesto la presencia o ausencia de secuencias génicas específicas. Se puede aplicar sobre núcleos interfásicos de extensiones celulares o cortes de tejido o directamente en cromosomas. La posibilidad de poder utilizar las técnicas de FISH sobre células que no están dividiéndose es importante en aquellas neoplasias con baja tasa de división celular, como en los síndromes linfoproliferativos crónicos. Para ello utiliza sondas marcadas con fluorocromos. Dependiendo del tipo de sonda utilizada es posible evaluar la presencia de reordenamientos en los núcleos. Las sondas son pequeñas secuencias de cadena sencilla de ADN, complementarias a la secuencia de interés del ácido nucleico. Podemos utilizar distintos tipos de sondas: Centroméricas o ADN satélite: estas sondas hibridan con las regiones α o β satélites u otras secuencias repetitivas de la región centromérica del cromosoma. Son de utilidad para detectar alteraciones cromosómicas numéricas. Como hemos dicho anteriormente, esta técnica puede aplicarse sobre células en división o núcleos interfásicos, por tanto podemos detectar anomalías cromosómicas numéricas sin necesidad de tener células en metafase. Las sondas de pintado cromosómico contienen una librería de secuencias genómicas que abarcan todo un cromosoma o una determinada región. Con estas sondas podemos detectar alteraciones estructurales o numéricas de los cromosomas, pero sólo en células en metafase. Es muy útil cuando tenemos cromosomas de mala calidad. Las sondas de secuencia única (locus específico), hibridan con secuencias cromosómicas muy concretas, correspondiente a una banda cromosómica o a un gen. Con estas sondas podemos visualizar alteraciones estructurales o numéricas tanto en núcleos en interfase como en metafase.