UNIVERSIDAD CENTROOCCIDENTAL “LISANDRO ALVARADO” DECANATO DE CIENCIAS DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE MEDICINA PREVENTIVA Y SOCIAL SECCION DE MICROBIOLOGÍA Microbiología Médica I TALLER DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS BÁSICAS UTILIZADAS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Yudy Aranguren, octubre 2011

PASOS PARA EL DIAGNOSTICO: 1.- MUESTRA: 2.- DIRECTO: Coloraciones: Gram 3.- CULTIVO 4.- PRUEBAS BIOQUIMICAS

PRUEBAS BÁSICAS PARA EL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE COCOS GRAM POSITIVO

PRUEBA DE LA CATALASA Son catalasa negativo: Son catalasa positivo: La determinación de la presencia de catalasa Se pone en contacto una pequeña cantidad de cultivo bacteriano de 24-48 horas de incubación, con en peróxido de hidrógeno (H2O2) al 3%. La liberación de O2 indica la presencia de catalasa. H2O2 + catalasa = H2O + ½ O2 Son catalasa positivo: Son catalasa negativo:

PRUEBA DE LA REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS Permite determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos por algunas especies bacterianas que poseen la enzima nitrato-reductasa Se agrega a un cultivo en caldo unas gotas de: - + - Reactivo A: solución de dimetilnaftilamina 0,6%. - Reactivo B: solución de ácido sulfanílico 0,8%. Se observa un cambio de color: Positivo: Rojo ladrillo Negativo: Sin cambio de color

FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS - + La fermentación de un carbohidrato (azucares) por un microorganismo en particular ayuda a su identificación. La acidez que se produce en el medio se pone en evidencia a través del cambio de color de un indicador de pH AGAR SALADO MANITOL Se puede evidenciar la producción de gas

PRUEBAS SEGUNDARIAS 1.- COAGULASA 2.- SENSIBILIDAD O RESISTENCIA A LA NOVOBIOCINA

- + - + PRUEBA DE LA COAGULASA La determinación de la presencia de la enzima coagulasa: Se pone en contacto una pequeña cantidad de cultivo bacteriano con plasma con anticoagulante e incubar 4 horas a 37ºC. COAGULASA POSITIVA NEGATIVA Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus + -

PRUEBA DE SENSIBILIDAD

SENSIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA SENSIBLE-SIN CRECIMIENTO RESISTENTE-CON CRECIMIENTO Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus NOVOBIOCINA NOVOBIOCINA Sin crecimiento alrededor del disco de Novobiocina Con crecimiento alrededor del disco de Novobiocina

CRECIMIENTO EN ALTAS CONCENTRACIONES DE SAL COCOS GRAM POSITIVOS - + Género Staphylococcus crece a altas concentraciones de sal (7% NaCl) Género Streptococcus NO crece a altas concentraciones de sal (7% NaCl) Género Enterococcus crece a altas concentraciones de sal de 6,5% per o NO a 7% NaCl

CRECIMIENTO EN ALTAS CONCENTRACIONES DE SAL Agar Salado Manitol: Crecimiento con o sin fermentación de manitol 1.- Género Streptococcus no crece a 7% de NaCl 2.- Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus saprophyticus Crecen y NO fermentan el manitol (color rosado del medio) 3.- Staphylococcus aureus crece y fermenta el manitol (color amarillo del medio)

PATRONES DE HEMÓLISIS

PATRONES DE HEMÓLISIS ALFA BETA GAMMA AGAR SANGRE BETA: Lisis total de los glóbulos rojos GAMMA: Sin lisis ALFA: Lisis parcial de los glóbulos rojos

PRUEBA DE CAMP Prueba de CAMP: Las especies del genero Streptococcus del grupo B ( BETA HEMOLITICOS) produce un factor que aumenta la beta hemólisis de una cepa indicadora de Staphylococcus aureus. Streptococcus pyogenes Staphylococcus aureus Streptococcus agalactiae

AUTOEVALUACIÓN TIPO DE HEMÓLISIS NO HEMOLITICO

CLASIFICACION DE LANCEFIELD PARA ESTREPTOCOCOS BETA HEMOLITICOS http://www.youtube.com/watch?v=Zks-2AZuZ1Y&feature=related

+ Partículas de látex cubiertos de anticuerpos específicos Extracto soluble de la pared celular por acción enzimática + Partículas de látex cubiertos de anticuerpos específicos CLASIFICACION DE LANCEFIELD PARA BETA HEMOLITICOS

PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LA BACITRACINA Pruebas para diferenciar estreptococos Beta hemolíticos (Grupo A y Grupo C) Con crecimiento alrededor del disco de Bacitracina Sin crecimiento alrededor del disco de Bacitracina

PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LA OPTOQUINA Pruebas para diferenciar Streptococcus pneumoniae y otros estreptococos Alfa hemolíticos (Streptococcus mitis) Streptococcus pneumoniae Streptococcus mitis DISCO DE OPTOQUINA DISCO DE OPTOQUINA Sin crecimiento alrededor del disco de Optiquina Con crecimiento alrededor del disco de Optiquina

PRUEBA DE SENSIBILIDAD A BILIS Pruebas para diferenciar Streptococcus pneumoniae y otros estreptococos Alfa hemolíticos (Streptococcus mitis) Streptococcus mitis NO lisado en presencia de Bilis Streptococcus pneumoniae lisado en presencia de Bilis

PRUEBAS BÁSICAS PARA EL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE BACILOS GRAM NEGATIVOS

PASOS PARA EL DIAGNOSTICO: 1.- MUESTRA: 2.- DIRECTO: Coloraciones: Gram 3.- CULTIVO 4.- PRUEBAS BIOQUIMICAS

FERMENTACIÓN DE LACTOSA EN MEDIO MAC CONKEY

PRUEBA DE MOVILIDAD Permite conocer si las bacterias en estudio son móviles o no, eso ayuda en el proceso de clasificación Se realiza una siembra pinchando el medio con la aguja bacteriológica, y tras incubar 24 h, se observa si se ha producido crecimiento entorno a la zona inoculada.

PRUEBA DEL INDOL Se cultiva la especie en estudio en un caldo rico en triptofano para que se produzca el Indol Se agrega al cultivo tres gotas del reactivo de Kovack (P-dimetil-aminobenzaldehido ) Se determina la presencia de Indol a través de la formación de un anillo rojo en la superficie del caldo + -

PRUEBA DEL CITRATO Determina si el organismo bacteriano en cuestión se desarrolla o no en un medio que contiene citrato como única fuente de carbono. Medio citrato de Simmons

KLIGLER: Agar triple azucar hierro

PRUEBA DE LA OXIDASA Prueba secundaria Permite conocer la presencia o ausencia del “citocromo C” en bacterias y es una característica fisiológica muy utilizada en taxonomía Prueba de oxidasa Se toma una pequeña cantidad de cultivo bacteriano de 24-48 horas de edad y se transfiere a un trozo de papel filtro previamente embebido en n,n-dimetil p-fenilendiamina Este reactivo es rápidamente transformado a un producto oxidado de color púrpura dentro de 30 segundos en presencia de citocromo oxidasa.