Reconocimiento e interacción molecular entre drogas y proteínas plasmáticas. Posibilidades de enantiodiferenciación S. Sagrado. 2009

1.- Introducción INTRODUCCIÓN

PROYECTO DE CONTINUA VIGENCIA EN LA COMUNIDAD CIENTÍFICA 1.- Introducción PROYECTO DE CONTINUA VIGENCIA EN LA COMUNIDAD CIENTÍFICA ESTUDIO DEL MODO EN QUE LAS DROGAS INTERACCIONAN CON LOS ORGANISMOS VIVOS EFECTOS TERAPÉUTICOS EFECTOS TOXICOLÓGICOS Problema no resuelto…

~ 10 años 600 millones € Comercialización 1.- Introducción ~ 10 años 600 millones € Ej. Comercialización Elevado coste Fase clínica (ensayos con humanos) Fase preclínica disminuir moléculas: Bajo índice de éxito Mejorar calidad (?) ‘Filtro rápido’

Evaluación farmacocinética, farmacodinámica y toxicológica 1.- Introducción Comercialización Evaluación farmacocinética, farmacodinámica y toxicológica droga candidata Ej. Procesos, interacciones, interrelaciones, etc. 5000 5 1 Farmacocinético (la fracción unida no puede ser distribuida, metabolizada o excretada) Farmacodinámico (solo la fracción libre es activa).

Evaluación farmacocinética, farmacodinámica y toxicológica 1.- Introducción Ej. Evaluación farmacocinética, farmacodinámica y toxicológica droga candidata 5000 5 1 Tradicionalmente: Consideraciones éticas Costosos Laboriosos In vivo Fase preclínica

Evaluación farmacocinética, farmacodinámica y toxicológica 1.- Introducción Ej. Evaluación farmacocinética, farmacodinámica y toxicológica droga candidata 5000 5 1 In vivo Métodos alternativos (alto rendimiento) Fase preclínica Reduzcan: el uso de animales de experimentación Tiempo, esfuerzo, costes ‘Filtro rápido’

1.- Introducción Métodos alternativos Organismos inferiores no protegidos Bacterias Hongos Protozoos Algas Plantas Animales invertebrados Vertebrados en las primeras etapas del desarrollo (embriones) Peces Anfibios Reptiles Aves Mamíferos Métodos “in vitro” (material biológico) Órganos Líneas celulares Métodos “in silico” (Modelos matemáticos, algoritmos optimización) Relaciones cuantitativas estructura-actividad (QSAR) “Docking” molecular, interacciones selectivas Métodos “in quimico” (Técnicas separación/analíticas + modelos matemáticos) Relaciones cuantitativas retención-actividad (QRAR) Electroforesis capilar (CE), interacciones selectivas

1.- Introducción Métodos alternativos Organismos inferiores no protegidos Bacterias Hongos Protozoos Algas Plantas Animales invertebrados Vertebrados en las primeras etapas del desarrollo (embriones) Peces Anfibios Reptiles Aves Mamíferos Métodos “in vitro” (material biológico) Órganos Líneas celulares Métodos “in silico” (Modelos matemáticos, algoritmos optimización) Relaciones cuantitativas estructura-actividad (QSAR) “Docking” molecular, interacciones selectivas Alejados del modelo animal ‘filtro rápido’ Sinergias Estructura, comput. Métodos “in quimico” (Técnicas separación/analíticas + modelos matemáticos) Relaciones cuantitativas retención-actividad (QRAR) Electroforesis capilar (CE), interacciones selectivas Moléculas, experimental

Docking/Interacción droga-proteínas plasmáticas (optimización) 1.- Introducción ‘Docking’ molecular Enfoque teórico (in silico) Docking/Interacción droga-proteínas plasmáticas (optimización) Objetivo: Cuantificar el grado de reconocimiento molecular (vía minimización de la energía libre del sistema) Conformación óptima (droga-proteína) … complejo estable Obtención de: - Constantes de afinidad (K i ) - “Protein binding” (PB %) INFORMACIÓN: + Estructura drogas + Estructura de las proteínas (Cristalografía RX, RMN) (Bases de datos) LIMITACIONES (actuales): - Nivel de exactitud limitado (Validación, métodos in quimico) - Tiempo de computación elevado (se solucionará con el tiempo) Generalización de los estudios

EC/Interacción droga-proteínas plasmáticas (equilibrio) 1.- Introducción EC EC/Interacción droga-proteínas plasmáticas (equilibrio) Enfoque experimental (in quimico) Equilibrar mezclas droga-proteína [D/P, Diseño experimental] Separar una fracción (ej. droga libre, d ) Cuantificar su concentración (d ) [Modelos de regresión] Obtención de las constantes de afinidad (K i ): ‘Protein binding’ (PB %): r : fracción de droga unida b : concentración de droga unida d : concentración de droga libre D : concentración total de droga P : concentración total de proteína m : clase de sitios de unión independientes ni : número de sitios de unión primarios/molécula proteína

EC/Interacción droga-proteínas plasmáticas (equilibrio) 1.- Introducción EC EC/Interacción droga-proteínas plasmáticas (equilibrio) Enfoque experimental (in quimico) Equilibrar mezclas droga-proteína [D/P, Diseño experimental] Separar una fracción (ej. droga libre, d ) Cuantificar su concentración (d ) [Modelos de regresión] VENTAJAS: Equipamiento simple, bajo consumo reactivos, relativa rapidez y elevada eficacia Adecuada para separar enantiómeros Aproximar condiciones fisiológicas

Desarrollo de drogas enantioméricamente puras 1.- Introducción Interés por los enantiómeros: INVERSIÓN Desarrollo de drogas enantioméricamente puras La naturaleza quiral de los sistemas vivos: implicaciones evidentes sobre la farmacodinamia, farmacocinética y toxicidad de las drogas quirales

2.- Objetivos OBJETIVOS

Objetivo primordial: Evaluar la sinergia, entre sistemas: 2.- Objetivos Objetivo primordial: Evaluar la sinergia, entre sistemas: - in quimico instrumentales basados en modalidades electroforéticas - in silico de ‘Docking’ molecular. Involucrar drogas quirales. 2 niveles: 1.- Posibilidades de cribado (discriminación), 2.- calidad de las estimaciones (predicción)

2.- Objetivos Objetivos concretos (1) Desarrollar/evaluar microsistemas electroforéticos para la evaluación de las interacciones selectivas/enantioselectivas droga-proteínas plasmáticas - Interacciones competitivas (o cooperativas) con compuestos endógenos y otras drogas

2.- Objetivos Objetivos concretos (2) Obtener información y parámetros derivados de interacciones selectivas/enantioselectivas de drogas mediante “Docking” molecular. - Análisis a nivel molecular de las principales fuerzas responsables de las interacciones. Proyecto colaborativo, Dr. K. Bissety. Durban University of Technology (DUT, Sudáfrica) Proyecto bilateral (HS2008-0002, Acciones integradas hispano-sudafricanas. MICIIN).

- Establecer relaciones entre parámetros 2.- Objetivos Objetivos concretos (3) Crear de una base datos con los parámetros obtenidos mediante las estrategias experimental y computacional - Incluyendo descriptores moleculares, datos del análisis a nivel molecular y de otros métodos in vitro, in vivo, etc. - Estudios QSAR: - Establecer relaciones entre parámetros - Evaluar consistencia de los resultados - Evidenciar limitaciones y posibilidades de mejora

3.- Metodología METODOLOGÍA (Resultados)

Interacciones selectivas droga (enantiómero)-HSA 3.- Metodología Interacciones selectivas droga (enantiómero)-HSA ‘Docking’ molecular

Interacciones selectivas droga (enantiómero)-HSA 3.- Metodología Interacciones selectivas droga (enantiómero)-HSA ‘Docking’ molecular Estimaciones computacionales Inicialmente módulos del programa QUANTUM® (q-Albumin, Docking, q-ADME, q-TOX) Realiza un cálculo automático de las constantes de afinidad a los dos sitios principales del HSA Se realizarán simulaciones basadas en las estimaciones K1 y K2 para ver como se ajustan a estos modelos teóricos a las estimaciones experimentales (EC) D = cte P = cte sitio I, warfarina sitio II, diazepam

Interacciones selectivas droga (enantiómero)-HSA 3.- Metodología Interacciones selectivas droga (enantiómero)-HSA ‘Docking’ molecular Estimaciones computacionales Inicialmente módulos del programa QUANTUM® (q-Albumin, Docking, q-ADME, q-TOX) Realiza la optimización de la interacción entre drogas y cualquier proteína de la que se disponga de la información estructural Puede emplearse para: Explorar otras proteínas plasmáticas Interacciones entre-moléculas - Información a nivel molecular Sitio 2 en el HSA Átomo de O (Diazepam) interactuando con el grupo OH del residuo Tyrosine 411 (zona polar dentro del bolsillo hidrofóbico del sitio 2 del HSA)

Interacciones selectivas droga/enantiómero-HSA 3.- Metodología Interacciones selectivas droga/enantiómero-HSA CE

Interacciones selectivas y enantioselectivas-HSA 3.- Metodología Interacciones selectivas y enantioselectivas-HSA CE Modalidad electroforética: Droga, enantiomero puro HSA Droga quiral (mezcla racémica de enantiómeros) CE-FA AGP Ultrafiltración (membrana) + ACE d Mezcla HSA - AGP Selector quiral: - Proteínas (HSA) Ciclodextrinas (neutras, aniónicas y catiónicas) Conjunto de proteínas plasmáticas (plasma/suero/ suero sintético) Ultrafiltración (membrana) + ZCE d FA: Análisis frontal ZCE: Electroforesis capilar zonal ACE: Electroforesis capilar de afinidad Ojo el selector altera el eq.

Interacciones selectivas y enantioselectivas-HSA 3.- Metodología Interacciones selectivas y enantioselectivas-HSA CE Ejemplo: (Resultados) 4 Antihistamínicos quirales-HSA Droga quiral (mezcla racémica de enantiómeros) Ultrafiltración (membrana) + ACE Selector quiral: - Proteínas (HSA) FA: Análisis frontal ZCE: Electroforesis capilar zonal ACE: Electroforesis capilar de afinidad Ojo el selector altera el eq.

Interacciones selectivas y enantioselectivas-HSA 3.- Metodología Interacciones selectivas y enantioselectivas-HSA CE Caracterización de la interacción de los enantiómeros: marcadores selectivos de los sitios de unión al HSA Desplazan a los enantiómeros (permitiendo reconocer el sitio de unión donde están unidos) SITIO III: Digitoxina SITIO II Diazepam SITIO I I Warfarina

Interacciones selectivas y enantioselectivas-HSA 3.- Metodología Interacciones selectivas y enantioselectivas-HSA CE (Antihistamínico) KE2 / KE1 1ª evidencia publicada de unión enantioselectiva de antihistamínicos quirales a HSA … Fenotiazinas quirales Modelo competitivo: los dos enantiómeros compiten por el mismo sitio (1 ecuación; [E1] y [E2]) Modelo independiente: los dos enantiómeros se enlazan a diferentes sitios (2 ecuaciones)

Reconocimiento e interacción molecular entre drogas y proteínas plasmáticas. Posibilidades de enantiodiferenciación S. Sagrado. 2009