BIOLOGÍA MOLECULAR TEMA 7.6 “AMPLIFICACIÓN DE DNA. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) 7.7 AMPLIFICACIÓN DE RNA. RETROTRANSCRIPCIÓN ACOPLADA A LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (RT-PCR). AIDA ELIANETH BERNABÉ MALDONADO 205206

RESULTADOS DE APRENDIZAJE Reconoce los fundamentos de síntesis in vitro de DNA, los elementos que participan y su función. Explica los procedimientos para la amplificación de fragmentos de DNA por medio de la tecnología de PCR, así como aplicaciones en diferentes campos y actividades humanas. Reconoce los fundamentos de síntesis in vitro de DNA a partir de moléculas de RNA, los elementos que participan y su función. Explica los procedimientos para la amplificación de RNA a fragmentos de DNA por medio de la tecnología de RT-PCR, así como aplicaciones en diferentes campos y actividades humanas.

PCR. (REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA)

PCR Es la amplificación de DNA in vitro por medio de la polimerización en cadena de DNA utilizando un termociclador. Únicamente puede analizar DNA a diferencia de la RT-PCR que analiza DNA y RNA El propósito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de DNA. Se realiza la amplificación de un segmento específico de DNA, teniendo poco material disponible.

La PCR es una reacción en cadena porque el número de cadenas nuevas de DNA se dobla a cada ciclo, y las nuevas cadenas, junto con las viejas, sirven de molde para el siguiente ciclo.

Fue diseñada por el Dr. Kary Mullis en 1987. Ganó el premio Nóbel de Química en 1993 por su invento. Utilizo el PCR para amplificación del gen de -hemoglobina humana, y el diagnostico prenatal de anemia falciforme.

REQUISITOS PARA PCR DNA molde. El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucleótidos de longitud. Dos primers específicos. Son secuencias cortas de nucleótidos, complementarias a una región del DNA que se quiere amplificar. Enzima DNA polimerasa. Termociclador. Es una máquina que calienta y enfría la reacción en periodos cortos de tiempo.

TERMOCICLADOR Un aparato con capacidad para calentar y enfriar rápidamente las muestras, de modo que se aprovechen las cualidades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos y las enzimáticas de la ADN polimerasa.

TUBOS DE PCR

ESTACIÓN DE TRABAJO

EL PCR IMPLICA TRES PASOS: 1. El DNA a clonar se desnaturaliza en cadenas sencillas. (90 a 95ºC) 2. APAREAMIENTO. (50º - 70ºC). Los oligonucleótidos o primers se unen al DNA de cadena sencilla. 3. EXTENSIÓN. A la mezcla de reacción se le añade una DNA polimerasa resistente al calor. (Taq. Polimerasa), extiende los primers añadiendo nucleótidos en dirección 5’- 3’

PASO 1: DESNATURALIZACIÓN Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla.

PASO 2: APAREAMIENTO Los “primers”, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares específicos por complementariedad de bases.

POLIMERIZACIÓN O EXTENSIÓN Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, y coloca nucleótidos de 5’a 3’ leyendo el DNA de 3’a 5’. De estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de DNA molde.

En el PCR hay una amplificación exponencial

Amplificación del DNA

Análisis de la Muestra La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante electroforesis. Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.

Análisis de la Muestra La posterior visualización se puede realizar con bromuro de etidio (lámpara de luz UV), tinción de plata, fluorescencia, radioactividad Ladder: pesos conocidos 1: Fragmento a 1857 pb 2 y 4: Fragmento a 800 pb 3: No hay producto 5: Multiples bandas (primers inespecíficos se pegan a varios sitios)

APLICACIONES Una región diana específica en el DNA genómico total puede amplificarse mediante PCR para utilizarse en la clonación

APLICACIONES DE PCR GENES Ejemplo de un caso de criminalística resuelto utilizando electroforesis en gel vertical de acrilamida. Si se observan los patrones bandas podrá comprobarse como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el sombrero (Hat) y pantalón (Jeans) del sospechoso (S) coinciden con el perfil genético de la víctima (V)

Utilización de PCR en medicina forense

VENTAJAS DEL PCR La PCR es rápida, y puede realizarse en unas pocas horas, en vez de días, en comparación con la clonación basada en células. El diseño de los primers para la PCR se hace automáticamente con un programa de ordenado, y la síntesis comercial de oligonucleótidos también es rápida y económica. Es muy sensible y, amplifica secuencias específicas de DNA a partir de pequeñas muestras de DNA prácticamente indetectables. También se pueden usar muestras de DNA que están parcialmente degradadas, que se encuentran mezcladas con otros materiales, o que están incluida en un medio (como el ámbar), lo que sería díficil o imposible con las técnicas de clonación convencional.

LIMITACIONES DE LA PCR Se debe disponer de alguna información sobre la secuencia de nucleótidos del DNA diana, y cualquier contaminación de la muestra con DNA de otras fuentes, por pequeña que sea, puede causar problemas. Por ejemplo, células desprendidas de la piel del investigador pueden contaminar las muestras recogidas del escenario de un crimen o tomadas de un fósil, lo que dificulta la obtención de resultados precisos. Las PCR siempre deben realizarse con controles adecuados cuidadosamente diseñados.

RT-PCR. (PCR CON RETROTRANSCRIPTASA)

RT-PCR (PCR CON RETROTRANSCRIPTASA) En este procedimiento, se utiliza retrotranscriptasa para generar copias de DNA complementario (cDNA) de cadena sencilla de las moléculas de RNAm. Con esta prueba se puede analizar tanto DNA como RNA a diferencia del PCR que unicamente se analiza DNA. A esta reacción le sigue una PCR que copia el DNA de cadena sencilla en moléculas de doble cadena, y luego éstas se amplifican y se producen muchas copias. Se añade la polimerasa Taq y cebadores aleatorios al cDNA de cadena sencilla, y tras la unión del primer, la Taq polimerasa lo extiende, haciendo un cDNA de doble cadena.

La retrotranscriptasa utiliza el RNAm como molde para sintetizar una cadena de DNA complementaria, y forma un dúplex RNAm/cDNA.

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APLICACIONES DE RT-PCR Como la técnica es capaz de analizar DNA o RNA: Se usa para determinar la carga vírica, contaminantes en la comida, sangre u otro tipo de muestras La expresión génica en distintos tejidos, la discriminación alélica, y la deleción o el grado de amplificación de los genes. Además, tiene aplicaciones clínicas muy importantes, como el diagnóstico de tumores, la respuesta a medicamentos en cánceres humanos y el perfil de citoxinas en la respuesta inmune.

REFERENCIA BIBLIOGRAFICA Alberts, Bruce; Molecular biology of the Cell; Third edition; 1994; Ed.Garland Publishing, págs: 508-510 Harvey Lodish, Arnold Berk, Paul Matsudaira, Chris A. Kaiser, Monty Krieger, Matthew P. Scott, S. Lawrence Zipursky, James Darnell. Biología Celular y Molecular. Quinta Edición. Editorial Médica Panamericana. Págs:375-378 William S. Klug; Michael R. Cummings. Conceptos de Genética, Prentice Hall, 5ª Edición. Capítulo 19.Tecnología del DNA recombinante. Págs: 540-545. http://gmein.uib.es/PCR/RTPCResp.swf