TECNICA HISTOLÓGICA y MICROSCOPÍA

ANATOMÍA e HISTOLOGÍA: permite reconocer la constitución y forma humana. El estudio comprende: Dimensión Microscópica: HISTOLOGÍA Dimensión Macroscópica: ANATOMÍA. Observación Microscópica: Se realiza por medios especiales ópticos o electrónicos que permiten la observación de detalles invisibles al ojo humano y requiere someter el tejido a procedimientos especiales que en conjunto constituyen la “Técnica Histológica”. Observación Macroscópica: Se realiza sobre organismos vivos, sobre cadáveres frescos o conservados, sobre esqueletos humanos verdaderos o artificiales ó, sobre maquetas de cuerpos humanos. Se realiza por medio de la observación directa del ojo humano desnudo o ayudado por lupas en ciertos casos.

La observación microscópica puede realizarse en forma inmediata o mediata. Inmediata: se realiza sobre el ser vivo al estado fresco, en algunos casos recurriendo a colorantes vitales que pueden ser ácidos como el azul trípano, azul de pirrol, carmín tritinado entre otros o básicos como el rojo neutro, verde janus, azul de metileno, azul crecil, azul nilo, etc. La coloración vital puede ser a su vez intravital por ingestión o inyección o supravital, la coloración se realiza sobre el elemento vivo, pero separado del organismo o sea in-vitro. Mediata o post mortem:requiere una serie de pasos para conservar el material de la descomposición natural cadavérica.

En forma resumida los pasos a seguir para la observación microscópica son: Obtención del material: por necropsia o biopsia. Fijación: para evitar descomposición y conservar las estructuras. Fijadores físicos: Calor (llama directa, estufa) ó frío (gas carbónico). Fijadores químicos: Simples (formol, alcohol, acetona, etc.) ó compuestos (líquido de muller, fleming, zenquer, vastarini, etc.). Inclusión: para facilitar los cortes que se realizan con navajas especiales o micrótomos. Lo más usado para inclusión es la parafina (para observación en microscopio óptico) y celoidina (para observación en microscopio electrónico). Corte y primer montaje: las láminas cortadas se montan o fijan sobre un portaobjetos. Coloración: para magnificar diferencias y contrastes de las estructuras tisulares.

Se utilizan: Reactivos colorantes que pueden ser: a) Colorantes naturales de origen animal como el carmín b) Colorantes de origen vegetal como orceína, hematoxilina, azafrán. c) Colorantes artificiales o anilinas. d) Colorantes indiferentes: son sustancias coloreadas que se disuelven en ciertas partes de las células como sudán III ó escarlata R que se disuelven en las grasas. e) Colorantes metálicos como las sales de plata y oro que se depositan en ciertas formas tisulares. 2. Reactivos diferenciantes: para eliminar el exceso de color en métodos de coloración regresiva. Por ejemplo agua amoniacal para el pasaje de la coloración de hematoxilina a la coloración con eosina. Conservación y segundo montaje: para la conservación se utilizan sustancias que evitan la descomposición de los tejidos y mantienen el color de las preparaciones como el bálsamo de canadá o el balsamo de tolú. El segundo montaje ó montaje definitivo sería la colocación del cubreobjetos para la conservación total del preparado.

MICROSCOPÍA: Entre los microscopios que se utilizan para las distintas observaciones encontramos: Microscopio óptico, microscopio de polarización, microscopio de contraste de fase, microscopio de interferencia, microscopio de fondo oscuro, microscopio electrónico. El microscopio óptico es el más utilizado. Es un microscopio basado en lentes ópticas, también llamado microscopio de luz o de campo claro, puede ser monocular o binocular. Está constituido por una parte mecánica, una óptica y una de iluminación. La parte mecánica es la que sostiene a los elementos ópticos, elementos de iluminación y los preparados a examinar. También se lo suele llamar estativo o montura. Está compuesto por el pie, columna, tubo, mecanismo de movimiento y platina. El pie es sólido y pesado, sostiene y da estabilidad al instrumento, generalmente tiene forma de herradura y los más modernos tienen una base cuadrada donde se incluye la fuente de luz.

La columna es el vástago vertical que se sostiene en el pie, en su punto medio, está destinada a ponerse en relación con el tubo del microscopio en forma directa o mediante brazos articulados. Presenta además, el mecanismo de cremalleras, que permite el acercamiento del preparado al objetivo, mediante los tornillos macro y micrométricos, para dar el enfoque adecuado, gracias al desplazamiento del objetivo o en algunos casos de la platina. El tubo sustenta el ocular en uno de sus extremos y el objetivo en el otro. Es un segmento cilíndrico fijado a la columna por la cremallera (tubo móvil) o formando cuerpo con ella (platina móvil). El ocular es la lente que corresponde al orificio proximal donde se apoya el ojo del observador, en los microscopios modernos permite acoplar cámaras fotográficas, proyector de láminas, etc. En el extremo inferior o distal se atornilla la lente objetivo. Lo más habitual es el uso del sistema de revólver, que es portador de varias lentes de distintos aumentos que con un simple giro interponen una de las lente objetivo en el trayecto óptico. El mecanismo de cremallera con tornillos macro y micrométricos puede desplazar tanto al tubo como a la platina.

La platina es una sección plana generalmente de metal, redonda o cuadrada que en su centro tiene un orificio que permite el paso de los rayos luminosos procedentes del sistema de iluminación, donde se coloca el preparado a observar. El condensador es una lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación o sea que produce un haz de luz que ilumina el objeto estudiado. El diafragma es un sistema que regula la cantidad de luz que llega al condensador. El Foco dirige los rayos luminosos hacia el condensador Básicamente el microscopio de lentes actúa como un artefacto amplificador en dos etapas. La lente objetivo proporciona la amplificación inicial y la ocular amplifica a su vez esta imagen primaria, o sea que el objetivo aumenta el objeto y proyecta la imagen sobre el ocular y el ocular aumenta aún más la imagen y la proyecta sobre la retina del ojo del observador. El aumento total resultante se determina mediante el producto del aumento del objetivo por el aumento del ocular.

El poder de resolución: distancia mínima que debe existir entre dos puntos del objeto para que se visualicen separados . Depende de la longitud de onda de la luz utilizada y de las aperturas numéricas del objetivo y del condensador. La calidad de una imagen depende del poder de resolución de un microscopio. Ojo! El ocular solo actúa aumentando la imagen del objetivo pero no mejora el poder de resolución). En general un microscopio corriente de buena calidad, puede dar ampliaciones de hasta 1.500 a 2.000 veces el tamaño del objeto observado, con una resolución de 0,2 micras, aunque con los preparados de rutina habituales rara vez excede de 0,5 micras. La capacidad de refracción o índice de refracción de un medio se define como la relación entre la velocidad de la luz en el vacío y en el medio en cuestión (aire, aceite, etc). Por lo tanto, el IR es una medida de la velocidad de dispersión de una onda luminosa a través del medio. La apertura numérica es una medida de la capacidad del microscopio de agrupar las refracciones de la luz producidas por los detalles finos del objeto y se expresa como AN= n x sen u, donde n es el índice de refracción del medio que separa el cubreobjeto del preparado de la lente frontal del objetivo, y u es la mitad del ángulo superior del haz de luz

La resolución de los microscopios ópticos, suponiendo que las aberraciones ópticas (geométricas o cromáticas) fueran despreciables, sería: El poder de resolución es función de la NA del objetivo y el condensador y de la longitud de onda de la luz utilizada. Y suponiendo una λ de entre 400 y 700 nm (0,4 y 0,7 μm). Si el medio es el aire la AN práctica máxima es de 0,95 y si el medio es aceite es de hasta 1,5 implicando que incluso el mejor microscopio óptico está limitado a una resolución de 0,2 μm (200 nm)

Amplificación de la imagen observada

Microscopio óptico

TEJIDOS FUNDAMENTALES Revestimiento EPITELIAL Glandular Neuroepitelio Conectivo propiamente dicho CONECTIVO De sostén Cartílago Hueso Hematopoyético Mieloideo Linfoideo Estriado MUSCULAR Liso Cardíaco Central NERVIOSO Periférico Receptores especiales