Metabolismo y rendimiento de los cultivos sobre superficies sólidas. Gustavo Viniegra González Universidad Autónoma Metropolitana, Iztapalapa, D.F. MEXICO (vini@xanum.uam.mx)

Esquema metabólico global Biomasa -DSX = DX/YC ATP Biosíntesis -DSin = DX/Yin Consumo total – DST= SO – S Respiración -DSQ = DX/YQ ATP  Mantenimiento -DSin =mXDt Productos  -DSP= DX/YP

Balance metabólico Consumo = Biosíntesis + Producción + Mantenimiento Balance: YX/S = gX/gS; YX/P = gX/gP; Yp/S = gP/gS Si DSP = 0;  (Modelo de J. Pirt)

Ciclo de vida de un moho Crecimento vegetativo Germinación Esporulación Crecimiento aéreo Diferenciación

Modelo macroscópico La tasa específica de crecimiento, r, está definida como r = (1/rA)drA/dt Se supone que, r, se anula cuando rA, se aproxima a, rAmax. Modelo de von Bertanlanffy r = m{1 – (rA/rAmax)n} rA << rAmax  r  m; rA  rAmax, r  0

Liberación de calor en la FMS de A Liberación de calor en la FMS de A. niger sobre bagazo de caña, con glucosa. Dos picos de calor: germinación y crecimiento. Crecen con la concentración del substrato. Datos de Oriol et al.

Medición de CO2 y O2 Componentes: Columnas de FMS. Cromatógrafo de gases. Computador. Beauveria bassiana sobre cutícula de grilo Tesis de D. Rodríguez, UAM (2009)

Respiración, metabolismo y crecimiento de A. niger vs. aw Harina de yuca y bagazo de caña, aw, aumenta por la adición de glucosa en el bagazo. Superior Respiración y consumo de substrato en la FMS Inferior aumenta com aw () Germinación () más breve com mayor aw Datos: E. Oriol et al.

FMS con suporte inerte A. niger en bagazo de caña, con jarabe de glucosa. El hongo creció con 400 g/L de glucosa!

Cultivo de Verticillium lecanii sobre cutícula de grillo J.E. Barranco-Florido et al. / Enzyme and Microbial Technology 30 (2002) 910–915

Respiración de Beauveria bassiana Salvado de trigo o cutícula de grilo. Dos fases respiratorias (Ikasari y Mitchell, 2000) Crecimiento exponencial b) Autólisis de parte de la biomasa Datos: D. Rodríguez, tesis doctoral en la UAMI, 2009

Balance respiratório Respiración -DSQ = DX/YQ ATP biosíntesis -DSx = DX/YX ATP  mantenimiento -DSm =mXDt Productos -DSP =YPDX + bXDt b está ligada à mantenimiento Si los flujos de O2 y S están equilibrados, → m/ << 1, (DSP = 0)  Y, const.. DS/DX = 1/Y+m/m  1/Y

Cociente respiratorio CR = DCO2/DO2 Ejemplos: C6H12O6 + 6O2 6 CO2+ 6H2O CR = 6/6 = 1 C6H12O6 + 2O2  2C2H4O2+ 2CO2 + 2H2O CR = 2/2  1 Es una indicación del tipo de metabolismo.

Modelo respiratorio* Se, X < XC (crecimiento exponencial) Se, X  XC ; t  tC (autólisis parcial) Biomassa X = X(activa) + X(inactiva) C. Lareo et al. / Enzyme and Microbial Technology 38 (2006) 391–399

Crecimiento y Respiración de Mucor bacilliformis Poliuretano. Crecimiento exponencial con Glucosa (100 g/L) Esporulación si el substrato se agota. C. Lareo et al. / Enzyme and Microbial Technology 38 (2006) 391–399

Cultivo de Gibberella fujikuroii por FMS Amberlita Substrato: Almidón (189 g/L) La giberelina es producida después de que disminuye la respiración. C. Gelmi et al. : Process Biochemistry 35 (2000) 1227–1233

catalases e peroxidases C6H12O6 2NAD 6NAD  6NADH2 2CH3CH2COOH 2NADH2 6O2 6CO2 6H2O2 6H2O2 → 6H2O +3O2 catalases e peroxidases Septo Spitzenkörper N O2 S

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) “La diferenciación … es una respuesta al estrés oxidativo”*. *Hansberg and Aguirre, 1990; Aguirre et al., 2005.

Las hifas vegetativas aireadas se pegan para formar hifas aéreas. Secreción de polisacáridos (PS) logX → ← PS A/V = 5 ← PS A/V = 1

El O2 induce la formación de las hifas aéreas “Cuando se aumentan o decrecen las concentraciones de oxígeno, ... Se observan, respectivamente, cantidades aumentadas o disminuídas de hifas aéreas ...” +H → Air húmedo, -H → Air seco, airO2→ 50% O2, airN2→ 50% N2 (Brit. Mycol. Soc. Symp. Series 27: 235-257, 2008)

La catalasa 3 de N. crassa regula los ROS ligados a la diferenciación. La mutante negativa, cat-3RIP, produce más hifas aéreas que Wt y más fotones asociados a la producción de ROS. (Brit. Mycol. Soc. Symp. Series 27: 235-257 2008)

La red regulatoria de la respuesta a los ROS en levaduras es muy compleja. Mcs1, Mcs2 e Mcs4 responden a H2O2. MAPK fosforila proteínas regulatorias. Cadena de respuestas génicas. Tomado de: Aguirre et al., Trends in Microbiology. 13(3): 111 ,2005.

Modelo del impedimento estérico* Densidade máxima, rmax  50 mg (sólidos)/cm3. Contenido de sólidos r0  150 mg /cm3. 2/3 de porosidad (aire) Para el intercambio de O2 y CO2. *Laukevics et al. B & B, 27: 1687 (1985). Dados de Nopharatana et al. B & B, 84: 71 (2003); Fotografía: D. Rodríquez, 2008

Relación entre densidades de superficie, rA, y de volumen, rV. rV = g/cm3 ; rA = g/cm2, h = cm; rV = rA/h densidad de volumen = densidad de superficie/espesor O2 hc  0.01 cm rV  0.05 g/cm3 rA = rVh ≤ 0.01 g/cm2 h  0.2 cm  hc S0 h

Agotamiento del O2 por R. oligosporus crecido en caja Petri hC = 60 mm; espesor de la capa crítica para el O2

¿Como se calculará el espesor crítico (hC) de un micelio? z z = hC C = C0(1-z/hC)2

Comentario sobre hC El valor de, hC = 0.01 cm = espesor de la capa aeróbica. Fué medido con electrodos sensibles a oxígeno. El valor h  hC, es el espesor de las capas aeróbica y anaeróbica

Integración de los modelos El micelio crece exponencialmente con un balance redox (Difusión = Consumo). Al llegar a un nivel rV < 0.05 g/cm3, la difusión de O2 es más lenta que su demanda. La penetración del oxígeno es, hC < 0.01 cm. El micelio con h > hC, es anóxico y no produce más biomasa, pero consume y transporta sustrato.

Crecimiento en capa fina La capa aerobia con espesor, hC, crece hasta que rV = rVmax O2 O2 O2 O2 La capa anaerobia consume substrato sin crecer. Yx/s decrece si, d  hC hC Capa aerobia  Capa anaerobia  Agar con substrato  d S S S S S S

Definición de s0 (g/cm2) S0 = concentración del sustrato dentro del soporte (g/cm3). A = área del soporte (cm2) V = volumen del suporte (cm3) s0 = S0V/A (g/cm2) s0 = Sustrato inicialmente disponible en toda la superficie de contacto con el micelio. a = A/V (área específica);  s0 = S0/a

Cálculos de a Placa con espesor, H;  a = 1/H Ejemplo: placa de agar H = 1 cm; a = 1/cm Cilindro con diámetro, d;  a = 4/d Ejemplo: fibra con d = 0.1 cm; a = 40/cm Esfera con diámetro, d;  a = 6/d Ejemplo: esferas con d = 0.02 cm; a = 300/cm

Volúmenes específicos (A/V) Matraz de 250 mL con V = 50 mL de agua Menisco de 0.06 cm de espesor A/V = 2/cm A/V = 333/cm

A. niger en PUF con glucosa ¿Por qué la pendente es fija para FMS ()? YX/S = 0.35 gX/gS ¿Por qué es variable para FSm ()? 0 < S0< 100g/L Datos de SJ Romero, 2001

Crecimiento de A. niger en caja Petri. rA  h  rV = rA/h rV no varía con s0 1/Y = 1/Y0 + s0/e Y0 = 0.5; si s0<< e (capa aeróbica) e = rVhmax = rAmax rA Datos de E. Ortega, 2012

Crecimiento en capa fina La capa aerobia con espesor, hC, crece hasta que rV = rVmax O2 O2 O2 O2 La capa anaerobia consume substrato sin crecer. Yx/s decrece si, d  hC hC Capa aerobia  Capa anaerobia  Agar con substrato  d S S S S S S

Modelo de Nopharatana et al. (1998, 2003)* El micelio aerobio crece h < hC hasta que rV  rVmax La capa aerobia sigue creciendo y formando nuevo micelio. La capa anaerobia transporta sustrato (translocación) El modelo no explica los resultados experimentales con Rhyzopus oligosporus (vea el Problema 3). *Biotechnol. Techniques,12(4): 313–318, 1998; B & B 84(1): 71-77, 2003

¿Qué controla las densidades de los hongos? Diferentes e1 con distintas cepas de A. niger. Diferentes e2 con la misma cepa de A. niger y diferente soporte. e1 (mg/cm2) = 15, vs.75; e2 = 0.8, vs. 74

Efecto de cepa y soporte sobre e Las mutantes con menor eficiencia, tendrán e menor. Los soportes con menos espacio intersticial tendrán e menor. mide la máxima producción de biomasa sobre la superficie. Cuando s0 < 1 mg/cm2 el rendimiento es máximo y similar para diferentes cultivos.

Consecuencias del modelo Dos fases respiratórias exponenciales: creciente y decreciente. La 1ª → metabolitos primários; la 2ª → metabolitos secundários, → esporulación. Transición: acumulación de espécies reactivas de oxígeno (ROS). La variación de s0 controla el espesor y tipo de metabolismo de la capa fúngica.

Aplicaciones: Control respiratorio en línea →control de la FMS. El O2 limita la densidad y espesor de la biomasa sobre superfícies sólidas. Pulsos de O2  esporulación.

Los pulsos de O2 aumentan la esporulación en superficie Tratamiento X=biomasa (mg cm-2) Conidia (x107conidia cm-2) YC/X (x107conidia mg-1 X) P (x105 conidia cm-2 h-1) 21% O2 4.78* (±0.25) 2.08 (±0.21) 0.43 (±0.05) 1.33 (±0.13) 26% O2 3.78 (±0.18) 4.25* (±0.13) 1.12* (±0.03) 2.72* (±0.08) Metarhizium anisopliae var. lepidiotum Tecuitl-Beristain et al. Mycopathologia (2010) 169:387–394

Problema 1 ¿Cuántas bandejas por lote quincenal se requieren para producir esporas de M. anisopliae, aplicadas en 5,000 Ha?¿Cuántas Ha cubrirá esa fábrica en 300 días? Datos: 1.36 kg (MS) de salvado de trigo por bandeja con partículas cúbicas de 0.05 cm de arista y 60% de humedad. C = 3x107 esporas por cm2. Cada Ha requiere 1012 esporas

Problema 2 Columnas con gránulos esféricos de almidón (d = 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 cm) y sales minerales. El almidón retiene una vez su volumen de agua y se degrada en un 80%. Un cultivo de A. niger, produce rendimientos Y = 0.69, 0.32, 0.24, 0.16 (gX/gS). Calcule, el área total de 1 kg (húmedo) de gránulos con d = 0.15 cm y densidad del sustrato 1.2g/cm3 Calcule e y estime la biomasa producida con ese d.

Problema 3 Compare los artículos de Oostra et al. (2001) y Rahardjo et al. (2002) sobre hC. Diga por qué los perfiles de oxígeno en el micelio explican las diferencias entre el modelo de Nopharatana et al. (1998) y sus resultados de 2003. ¿Cómo se imagina la capa de Rhyzopus oligosporus?

Problema 4 Explique por qué los cultivos aireados de A. niger sobre partículas de agriolita, pueden metabolizar jarabes hipertónicos de glucosa (300 g/L). Suponga que las partículas tienen A/V = 50/cm y que Y0 = 0.5, e = 0.001 g/cm2. Calcule Y. Discuta qué tipo de metabolismo estará ocurriendo. ¿Cómo será el cociente respiratorio? Revise el Balance Metabólico