Métodos de detección de HPV VIII JORNADA DE CONTROVERSIAS EN GINECOLOGIA Biología molecular y genética Murcia, viernes 23 de Mayo de 2008 - 16 a 20 horas Métodos de detección de HPV Emma Iborra Lacal Especialista Anatomía Patológica Hospital “Los Arcos”. Santiago de la Ribera. Murcia

Métodos de detección de HPV La infección persistente por HPV es condición necesaria para el desarrollo del carcinoma de cérvix. Utilidades clínicas de la detección de HPV: 1. Información complementaria en citologías anómalas. 2. Cribado poblacional.

Métodos de detección de HPV

Métodos de detección de HPV

Métodos de detección de HPV.(1) MORFOLOGÍA LIMITACIONES: Sensibilidad para H-SIL 60-80%. Errores en el muestreo e interpretación. Dificultad de obtener células glandulares atípicas. Falsos positivos 5-50%. Falsos negativos 30%

Métodos de detección de HPV. (2) BIOMARCADORES PROTEICOS -Indicadores del estado celular tras infección por HPV. -Predecir progresión o regresión de la infección.

Métodos de detección de HPV. (2) BIOMARCADORES PROTEICOS Doorbar J. Molecular biology of human papillomavirus infecton and cervical cancer. Clinical Science (2006) 110, 525-541.

Métodos de detección de HPV. (2) BIOMARCADORES PROTEICOS Doorbar J. Molecular biology of human papillomavirus infecton and cervical cancer. Clinical Science (2006) 110, 525-541.

Métodos de detección de HPV. (2) BIOMARCADORES PROTEICOS

Métodos de detección de HPV. (2) BIOMARCADORES PROTEICOS Identifica células displásicas con S 70-100% y E 34-100%. Mejora la concordancia interobservador. Buen marcador de progresión a carcinoma invasor. No aporta información de serotipo HPV.

Métodos de detección de HPV. (2) BIOMARCADORES PROTEICOS Ki-67, PCNA Expresión variable y condicionada por factores múltiples. CDC2, CDC6 y MCM5 Sobreexpresión en células displásicas. Son necesarios más estudios para demostrar su potencial como biomarcador en carcinoma de cérvix.

Métodos de detección de HPV. (3) ÁCIDOS NUCLEICOS

Métodos de detección de HPV. (3) ÁCIDOS NUCLEICOS Sonda directa: Southern Blot - Hibridación in situ

Métodos de detección de HPV. (3) ÁCIDOS NUCLEICOS 2. Amplificación de señal: Digene Hybrid Capture®(HC2) “Captura de híbridos” (inmunoensayo) Captura y detección de híbridos Especimen desnaturalizado Luminiscencia Hibridación con sonda de ARN

Métodos de detección de HPV. (3) ÁCIDOS NUCLEICOS 3. Amplificación de molécula diana: PCR para detectar L1. Primers múltiples(MY09/11, GP5/6, PGMY09/11, SPF10…).

Métodos de detección de HPV. (3) ÁCIDOS NUCLEICOS CLART ® Papillomavirus humano 2 (Genomica): Genotipado de 35 tipos de HPV. Microarray de baja densidad en plataforma de 96 pocillos o tiras de 8 pocillos. 1. Producto amplificado marcado con biotina. 2. Hibridación con sonda específica. 3. Incubación con conjugado STRV-Peroxidasa. 4. Precipitado que se detecta por lectura automática.

Métodos de detección de HPV. (3) ÁCIDOS NUCLEICOS POSITIVO NEGATIVO SONDA DIRECTA Sothern Blot es “gold standard” Baja sensibilidad, laborioso, requiere grandes cantidades de DNA. No se puede usar en muestras parafinadas AMPLIFICACIÓN DE SEÑAL Kits comerciales Análisis cuantitativo Aprobado por la FDA (HC2) Patente AMPLIFICACIÓN DE MOLÉCULA DIANA Tecnología flexible (carga viral, genotipo) Muy sensible Uso exclusivo para investigación. No estandarización. Probabilidad de contaminación. “Human papillomavirus testing methods”. Roger A. Hubbard. Arch Pathol Lab Med 2003;127:940-945

Métodos de detección de HPV. (3) ÁCIDOS NUCLEICOS CAPTURA DE HÍBRIDOS Hibridación de una sonda de ARN al ADN complementario de la muestra problema. Detección quimioluminiscente de los híbridos expresadas en RLU. Muestra positiva si RLU≥1. 13 serotipos de HPV de alto riesgo.

Métodos de detección de HPV. (3) ÁCIDOS NUCLEICOS CAPTURA DE HÍBRIDOS Sensibilidad clínica 85-100%. Detección mínima de 1pg/ml ≈120.000 partículas de virus Procedimiento simple y de alto rendimiento con buena reproducibilidad.

Métodos de detección de HPV. (3) ÁCIDOS NUCLEICOS CAPTURA DE HÍBRIDOS NO especifica tipo de HPV. Reactividad cruzada con serotipos de bajo riesgo. Detecta presencia de genoma estructural vírico (L1), por lo que mutaciones o delecciones en esas regiones podrían pasar desapercibidas.

Métodos de detección de HPV Results A total of 10,154 women were randomly assigned to testing. Both tests were performed on all women in a randomly assigned sequence at the same session. The sensitivity of HPV testing for cervical intraepithelial neoplasia of grade 2 or 3 was 94.6% (95% confidence interval [CI], 84.2 to 100), whereas the sensitivity of Pap testing was 55.4% (95% CI, 33.6 to 77.2; P = 0.01). The specificity was 94.1% (95% CI, 93.4 to 94.8) for HPV testing and 96.8% (95% CI, 96.3 to 97.3; P<0.001) for Pap testing. Performance was unaffected by the sequence of the tests. The sensitivity of both tests used together was 100%, and the specificity was 92.5%. Triage procedures for Pap or HPV testing resulted in fewer referrals for colposcopy than did either test alone but were less sensitive. No adverse events were reported. Conclusions As compared with Pap testing, HPV testing has greater sensitivity for the detection of cervical intraepithelial neoplasia. (Current Controlled Trials number IRSCTN 57612064)

Métodos de detección de HPV: Últimos sistemas. 1. Inform ®HPV (Ventana): Sistema automático de hibridación in situ, preservando morfología. Distingue ADN integrado y episomal.

Métodos de detección de HPV: Últimos sistemas. 2. Invader® (Third Wave Molecular Diagnostic): Hibridación DNA con sonda específica y tras digestión enzimática, detección por señal fluorescente. Equipamiento estándar, fácil de usar, no necesita entrenamiento específico. Datos iniciales limitados.

Métodos de detección de HPV. PERSPECTIVAS FUTURAS Detección de mRNA de E6/E7(PreTect HPV-Proofer®. Norchip AS): Detecta persistencia de infección Muestra infección activa Evita seguimiento clínico innecesario Identifica genotipo vírico

Métodos de detección de HPV: ¿Cuál es el mejor método? HC2 es la elección conservadora de la FDA para el cribado de ASCUS y/o adyuvante a la citología. La hibridación in situ y la tecnología Invader® son Reactivos Analíticos Específicos competentes. Necesidad de datos adicionales. La PCR se convertirá en el método más destacado si mejora el coste-efectividad, con sensibilidad analítica aumentada y nuevo desarrollo de algoritmos.