CONSERVACIÓN DE CULTIVOS PARA LA BIOTECNOLOGÍA Y LA INDUSTRIA Claudio Voget

Porque y para que conservar los cultivos ? El cultivo (cepa microbiana o viral, linea celular, etc), es el elemento vital de la investigación o producción industrial Conservar implica mantener la pureza, viabilidad y propiedades genéticas del cultivo durante un determinado período de tiempo Consecuencias de una adecuada conservación: estabilidad de las cepas de producción, reproducibilidad de la investigación. Reposición

Los tres objetivos de la conservación: 1.-Mantenimiento del cultivo puro (PUREZA) 2.-Que este vivo (VIABILIDAD) 3.-genética estable (ESTABILIDAD)

Conservación de cultivos Espacio físico e infraestrutura Personal capacitado Recursos económicos Inversión Potencial limitación de los métodos para conservar Daño económico Pérdida del cultivo

Historia y evolución de las técnicas de conservación (1) 1677 van Leewenhoek (Holanda): animalículos en agua y cerveza 1830 Cagniard-Latour (Francia): alcohol es producido por bacterias 1860 Pasteur (Francia): fermentación = microorganismos. Emplea como medios sólidos, papa y melón 1870 O. Brefeld emplea gelatina para solidificar los medios. Describe el cultivo de P. Glaucum (cultivo monospórico  micelio  conidios) 1881 Loeffler caldo nutritivo, Koch le incorpora agar (Mrs. Hesse) 1890 Hansen desarrolla la técnica del cultivo puro con levaduras 1900 Cultivos puros de bacterias y levaduras de mantienen en medios sólidos a base de caldo nutritivo y extracto de malta y se propagan periódicamente. Se requiere conservación a largo plazo para preservar las características de los cultivos

Historia y evolución de las técnicas de conservación (2) 1907 Will preserva levaduras en 10 % sacarosa durante 8 años, pero hay pérdida de actividad 1909-1911 Shackel; Hammer: primeros métodos de liofilización para bacterias y virus, empleo de suero y leche como protectores 1914 Lumiere y Cherrotier conserva cultivos de Gonococcus bajo una capa de parafina líquida, el método es perfeccionado por Morton y Pulski (1938) 1945-1950 La producción industrial de antibióticos estimula el desarrollo de nuevas técnicas. Liofilización, crio-conservación, adsorción en suelo, etc; permite el mantenimiento de cultivos por 10 o 20 años. 1950 Se descubre el efecto crioprotector de varios compuestos: glicerol, dimetilsulfóxido, sacarosa 1958 Sakane desarrolla la técnica para el secado desde el estado líquido (L-drying )

Historia y evolución de las colecciones de microorganismos 1890 Frantisek Kral genera la primera colección de bacterias y hongos en Praga. Cepas de Mycobacterium (Koch). Cierra en 1911. Se pierden las cepas Desarrollo de colecciones privadas 1906 Se publica el primer catálogo de cepas de hongos de la International Botany Association (Holland). Es el antecesor del CBS (Centraal Bureau voor Schimmelcultures) 1911 Colección de bacterias en el National History Museum of New York City. Es el antecesor del ATCC (American Type Culture Collection) fundado en 1925 1944 Takeda Chemical Industries, Ltd. funda el Institute for Aerial Fermentation para aislar, conservar y distribuir microorganismos, es el antecesor del Institute for Fermentation (IFO, Osaka) 2003 23 instituciones internacionales autorizadas para recibir material biológico con una patente de aplicación (Tratado de Budapest 1991)

Potenciales ventajas del depósito de material biológico Patentamiento Conveniencia logística del almacenamiento centralizado Seguridad de abastecimiento del material ante pérdidas eventuales Adecuada información de los riesgos ambientales y para la salud Seguridad en la conservación

Esquema del proceso de conservación y sus etapas críticas Aislamiento primario Microorganismo viable (genética/fenotípo) Reactivación 3 cultivo 1 Almacenamiento Tipo de propágulo Estado fisiológico Proceso de conservación 2

Métodos de conservación de cultivos 1. con crecimiento transferencia seriada 2. con metabolismo limitado agua destilada bajo aceite mineral (control por O2) 3. con metabolismo detenido 3.1 Congelamiento (crioconservación) 3.2 Deshidratación L-drying: secado desde la fase líquida, silicagel, celulosa (papel), suelo, perlas de porcelana Liofilización (freeze-drying)

CRIOCONSERVACIÓN Crioconservación es la conservación de material biológico a muy bajas temperaturas Rango -20 ºC a -196 ºC (nitrógeno líquido) El nitrógeno líquido es la temperatura práctica mas baja disponible. A la temperatura de equilibrio, la difusión molecular es extremadamente lenta y la probablilidad de que ocurran reacciones químicas es prácticamente nula

CRIOINJURIA El proceso de congelamiento y descongelamiento produce cambios en las céluas que pueden resultar letales Los procesos perjudiciales son: formación de cristales de hielo, exosmósis, aumento de la solubilidad de gases, deshidratación, aumento de la concentración de osmolitos, disminución del pH, alteraciones de la actividad enzimática, acumulación de metabolitos, incremento del contacto entre moléculas, ruptura de puentes de H, distorsión de macromoléculas, solidificación, pérdidad de la integridad de membranas, ruptura de emulsiones, etc La formación de hielo intra o extracelular es quizás el evento mas crítico de la crioinjuria.

INJURIA POR CONGELAMIENTO Hielo extracelular Congelamiento lento (efecto soluto) shrinkage (efecto soluto) exosmósis Congelamiento rápido ( efecto hielo ) Hielo intracelular Daño mecánico

CRIOPROTECCIÓN Control de la velocidad de enfriamiento Balance óptimo entre el efecto soluto y la formación e hielo. En la práctica es aceptable 10 ºC/min. El descongelamiento debe ser lo mas rápido posible Incorporación de crioprotectores (CPs) CPs que permean la pared y membrana celular Me2SO ( Tp < 30 min), Glicerol, Metanol Cps que permean la pared pero no la membrana mono y disacáridos, aminoácidos, polímeros de bajo PM(PEG 600-1000) Cps no permeantes Polímeros de alto PM: proteínas, polisacáridos, PVP

CRIOPROTECCIÓN El tipo de protección que ejerce el CPs depende de su permeabilidad Todos los CPs son altamente hidrofílicos CPs que permean totalmente ligan agua intracelular y reducen el efecto soluto CPs semipermeables forman entre la pared y la membrana celular una capa que proteje la célula del daño mecánico CPs no permeables se adorben en la superficie celular incrementando la viscosidad local lo cual manteniendo el hielo en forma amorfa evitando daño mecánico

Empleo de CPs en criopreservación Frecuencia de uso de CPs Virus: Me2SO, Suero sanguíneo, Sacarosa Glicerol Bacterias: Me2SO, Suero sanguíneo, Sacarosa, Glicerol, leche descremada Hongos: Me2SO, Glicerol Algas: Me2SO, metanol, Glicerol, PVP Protozoarios: Me2SO, Suero sanguíneo, Glicerol, Sangre desfibrinada Rango de concentraciones de CPs Me2SO: 1-32 % (media 10 %) Glicerol: 5-50 % Sacarosa: 1-68 % (media 10 %) Metanol: 2-10 % (media 5 %) Tiempos de contacto CPs-célula: Glicerol, Metanol, Me2SO : 10-60 min a 0-10ºC

CONSERVACIÓN POR DESHIDRATACIÓN Este método implica la remoción de agua de las células (humedad final típica: 0.06-5.0 % de agua). La deshidratación puede llevarse a cabo desde la fase líquida (L-drying) o por sublimación desde el estado congelado (liofilización) Las pérdida de viabilidad durante la deshidratación es principalmente atribuida a alteraciones de la membrana celular. Las células deshidratadas son susceptibles al deterioro causado por oxígeno El deterioro de las células durante la deshidratación puede ser controlado por el agregado de aditivos. Algunos forman una matriz amorfa que dispersa los componentes tóxicos que la célula puede liberar durante el secado. Otro protectores interactúan con las membranas, estabilizando su estructura en el estado anhidro Los aditivos mas comunes son: leche descremada, aminoácidos (glutamato) y azúcares (sacarosa, trealosa)

Principios de la liofilización muestra + protectores en ampollas vacío 30-60 militorrs manifold -70 ºC  - 5 ºC Bomba de vacío de aceite trampa de agua congelamiento etilenglicol + hielo seco (- 40 ºC) etanol + hielo seco (-70 ºC) La muestra colocada en una ampolla estéril con un plug de algodón, se congela entre - 40 ºC y -70 ºC. Una vez colocada la muestra en el manifold del equipo se comienza con el vacío y se retira el enfriamiento. La temperatuyra sube hasta -5 ºC. A esta temperatura y con un vacío entre 30 y 60 militorrs, el secado es rápido. El tiempo es variable y depende del volumen de muestra. Al finalizar el proceso se sella la ampolla al vacío

Preservación en suelo (sandy loam) para microorganismos filamentosos L-Drying perlas de porcelana, papel de filtro, suelo Impregnación en soporte Secado sobre silicagel Muestra Preservación en suelo (sandy loam) para microorganismos filamentosos Secar suelo 6 hs a 150 ºC Tamizar suelo seco mesh 10 y 20. Conservar en recipiente tapados Colocar en tubos Pyrex de 13 x 100 mm suelo seco tamizado hasta una altura de 20 mm y tapar con plug de algodón recubierto de gasa Autoclar 60 min 3 días consecutivos y secar Incorporar 1 ml de suspensión de esporos en agua ( no emplear caldo de cultivo) Secar a temp ambiente (24 ºC) un mes Conservar en frío

Consideraciones para la preservación de cultivos Debe definirse claramente el medio de cultivo y el tipo de agua (destilada, deionizada, corriente) empleados. Tener en cuenta el tipo de cultivo (agarizado, líquido, sólido), el estado fisiológico de las células al momento de la cosecha (cultivos líquidos cosechados en fase estacionaria suelen ser mas resistentes que los de fase logarítmica), si se emplean células con medio ó lavadas. Determinar si el agente protector es tóxico. Definir condiciones de proceso: concentración de células, tiempo de secado, agregado de protectores En procesos industriales la viabilidad no es lo único importante. La cepa debe mantener sus propiedades productivas. Desarrollar un test de producción o bioensayo Durante la recuperación de la especie conservada deben determinarse: viabilidad, pureza, morfología, formación de producto, rasgos recombinates (plásmidos, resistencia a antibióticos, etc).

Comparación de algunos métodos de preservación Almacenamiento (años) Ventajas Desventajas Agar 0.5-2 Simple, bajo costo, equipamiento requerido bajo Secado del agar, baja estabilidad genética, riesgo contaminación Aceite mineral 2-20 bajo costo, equipamiento requerido bajo trabajo moderado, baja estabilidad genética Congelamiento 4-5 Equipamiento requerido bajo, buena estabilidad genética Requiere protectores, Alto costo de freezer (-80ºC). Células pueden ser sensibles al O2 N líquido infinito Preparación rápida, buena estabilidad genática Suministro regular de N líquido Liofilización 15-20 Bajo riesgo de contaminación, buena a regular estabilidad genática Alto costo de equipamiento Agua 1-5 Simple , bajo costo, bajo equipamiento requerido Estabilidad genética regular L-drying 3-10 estabilidad genética?