CRECIMIENTO MICROBIANO Una célula toma compuestos químicos del medio (nutrientes) necesarios para su crecimiento y mantenimiento, al mismo tiempo origina productos de desecho que libera al medio.

Requerimientos nutricionales de los microorganismos La síntesis de nuevo material celular. Procesos anabólicos Las células toman del medio ambiente compuestos químicos que necesitan para: Para la producción de energía (ATP) Procesos catabólicos Los elementos químicos básicos a partir de los cuáles la célula sintetiza sus componentes celulares provienen del exterior y se los denominan nutrientes.

Por lo tanto los nutrientes son tomados por las células y transformados en constituyentes celulares (ej. proteínas, polisacáridos, lípidos, ácidos nucleicos) o utilizados para la generación de energía. Composición química de una célula.

Reacciones químicas en las células: 1. Biosíntesis celular (procesos anabólicos): Reacciones implicadas en la síntesis de material celular. Ej. Síntesis de pequeñas moléculas (unidades básicas de las macromoléculas). Síntesis de cofactores y coenzimas. Síntesis de macromoléculas, las cuáles implican reacciones de polimerización (ej. síntesis de DNA, RNA, proteínas). Se formarán las estructuras celulares tales como: pared celular, membrana citoplasmática, flagelos, ribosomas, complejos enzimáticos, etc. 2. Producción de energía (ATP) (procesos catabólicos) Las células necesitan energía para: Biosíntesis de material celular. Mantenimiento celular (movimiento celular, transporte de nutrientes, etc.).

No todos los microorganismos tienen los mismos requerimientos nutricionales. Es necesario por lo tanto conocer cuáles son los requerimientos nutricionales de los microorganismos para diseñar medios de cultivos apropiados. Los medios tienen que aportar la fuente de carbono y energía (FCE). Fuente de nitrógeno Micronutrientes y macronutrientes Factores de crecimiento (vitaminas) Cuando los requerimientos nutricionales de los microorganismos están asegurados y los factores físicos tales como pH, temperatura, aireación, etc. son adecuadamente controlados los microorganismos crecerán:

CRECIMIENTO CELULAR Cuando un microorganismo se encuentra en un medio de cultivo apropiado, que contiene todos los requerimientos nutriciones, comienza a crecer. El crecimiento se define como un aumento en el número de células microbianas o masa celular. En organismos unicelulares el crecimiento conduce a un aumento en el número de células más que un aumento en el tamaño celular. Cuando una célula crece, todos su componentes químicos aumentan en cantidad apropiada.

Ciclo celular procariótico: Fisión binaria En la mayoría de los procariotas, el crecimiento de una única célula continúa hasta que se divide en dos nuevas células, proceso llamado “fisión binaria”. Durante el crecimiento todos los constituyentes celulares incrementan en número de tal manera que cada célula hija recibe una copia de todos los constituyentes celulares que le permitirán vivir como célula independiente. El tiempo para completar “un ciclo celular” dependerá de factores genéticos y nutricionales. Ciclo celular procariótico: Fisión binaria El intervalo de tiempo para la formación de dos células hijas a partir de una, supone una generación. El tiempo transcurrido para que esto ocurra se llama “tiempo de generación”. Durante cada generación tanto el número de células como la masa celular se duplican.

El tiempo de generación, varía entre los distintos microorganismos y según las condiciones de crecimiento. Algunos tienen tiempos de generación de 1-3 h. Otras de 10 min. Otras pueden tardar días.

Crecimiento microbiano La velocidad de crecimiento se define como el aumento en el número de células o masa celular por unidad de tiempo y dependerá de: Crecimiento microbiano Condiciones del cultivo Factores genéticos * Temperatura * Comp. del medio de c. * pH

La curva de crecimiento se divide en las siguientes fases CULTIVO BATCH Es un recipiente cerrado, en el que no existe aporte continuo de nutrientes, ni drenaje de células ni de sustancias de desecho, los microorganismos unicelulares crecen según la denominada “curva de crecimiento microbiano”. La curva de crecimiento se divide en las siguientes fases

Fase de retardo ( fase “lag”): Es el período de tiempo durante el cual el inóculo se adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha sembrado. La duración de esta etapa depende de la cantidad inicial de inóculo, edad y estado fisiológico de las células. 2. Fase de crecimiento exponencial (fase logarítmica). La concentración de biomasa (x) comienza a aumentar en forma lenta y luego más rápidamente, hasta llegar a una etapa en la cual las células crecen a una velocidad específica máxima y constante (m). Esta etapa se denomina fase logarítmica o fase exponencial. El incremento por unidad de tiempo de la masa celular, Nº de células, ADN, ARN, proteínas, etc., se mantienen en un valor constante. Crecimiento balanceado o equilibrado. 3. Fase estacionaria: Luego de la fase exponencial hay un rápido período de desaceleración causada por el agotamiento de algún nutriente (el sustrato limitante) o por acumulación de inhibidores, se entra en la llamada fase estacionaria. 4. Fase de muerte: Se produce a muerte y en algunos casos lisis celular. Se debe al agotamiento de reservas de energía.

1, 2, 2x2, 2x2x2, 24, ..., 2n Crecimiento exponencial Este modelo de incremento de la población, en el que en cada período fijo de tiempo se duplica el número de células, se denomina crecimiento exponencial . X o N Durante el crecimiento exponencial la velocidad de crecimiento (dx/dt) es inicialmente lenta pero se incrementa con el tiempo. Tiempo 1, 2, 2x2, 2x2x2, 24, ..., 2n N0 = número inicial células/ml N= número final de células/ml N = N0 x 2n

1, 2, 2x2, 2x2x2, 24, ..., 2n Número de generaciones N = N0 x 2n X = Xo . 2n N0 = número inicial células/ml N= número final de células/ml n = número de generaciones Tomando logaritmos : log N = log N0 + n. log 2 Por lo tanto: n = (log N - log N0) / log 2 Se puede calcular el número de veces que la población se duplica en el tiempo t (td): TIEMPO DE DUPLICACIÓN: td = t /n

Ecuaciones que representan la fase de crecimiento exponencial (fase logarítmica). La velocidad de crecimiento es proporcional al número de células o masa celular presente. rx = dx/dt = . x (ec.1) o dN/dt =  . N donde: N = número de células (nº cél./ml) x = concentración celular (g/ml) t = tiempo de incubación (h) = velocidad específica de crecimiento (h-1) (característico para cada microorganismo en cada medio determinado). Integrando la ec.1 ( = max = cte. fase exp.) ln x = ln xo + m. t (ec.2) o Ln N = ln No + m . t (xo = biomasa a to = 0 )

xf = xo . em.t ln x = ln xo + m. t (ec.2) o Ln N = ln No + m . t Representando el ln x (o ln N) en función de t, se obtiene una línea recta de pendiente m y ordenada al origen ln xo (o ln No). xf = xo . em.t La ec. 2 puede ser descrita: x (o N) varían exponencialmente con el tiempo. Crecimiento exponencial o logarítmico

Tiempo de generación o de duplicación Tiempo de generación (tg): es el tiempo que transcurre para que se formen dos células a partir de una (un ciclo celular) o para que la población se duplique (tiempo de duplicación td). ln x = ln xo + m. t (ec.2) Considerando x = 2 xo y reemplazando en la ec. 2 se obtiene: ln 2 xo - ln xo = m. td td = ln2 /m ( ec. 3)

METODOS PARA MEDIR EL CRECIMIENTO MICROBIANO: A. MÉTODOS DIRECTOS: A.1. Determinación del peso seco: Suspensión celular, se separan las células por centrifugación, se lavan y secan en estufa hasta peso constante. Limitaciones: se precisan de 1.109 a 5 .109 cel para formar 1 mg de sustancia seca. Consume tiempo.

A.2.Recuento de células totales (recuento directo): Cámaras de recuento especiales (Neubauer) Son portaobjetos excavados de volumen perfectamente conocido cuando se sella herméticamente con cubreobjetos resistentes. Limitaciones: Poco sensible, se requiere una concentración de 107 cel/ml, o más para que se pueda observar una célula en el campo microscópico. Poco práctico para una gran cantidad de muestras. Requiere tiempo y habilidad. Se cuentan tanto células vivas como muertas (recuento total). Ventajas: rápido y poco material implicado.

A.3.Método del Recuento en Placa Se basa en la capacidad de una célula viable de formar una colonia en un medio de cultivo adecuado Standard (PCA). Por lo tanto se cuentan colonias, cada una proviene de una sola célula viable. (Célula viable: capaz de dividirse y formar células hijas.) a) Método de extensión en placa (o en superficie): 0,1 ml de la suspensión celular se extiende sobre la superficie de la placa usando una espátula de Drigalski. La placa se incuba y se cuentan las colonias. b) Método de vertido en placa (en volumen). 1 ml de la suspensión en la placa y se agrega el agar fundido a 45 ºC. Nº de colonias: 30 a 300 col./placa

Ventajas: * Elevada sensibilidad, se pueden contar muestras con pocas células. Determina sólo microorganismos viables. Desventajas: * Las colonias deben provenir de 1 sola célula (problemas con microorganismos que dan grumos o cadenas). * Precisa distintos medios para diferentes microorganismos. A.4.Método del NMP Se efectúan diluciones decimales de la población inicial, las que se incuban a temperatura adecuada en tubos conteniendo medios de cultivos líquidos standards. Los tubos que contengan células se observará desarrollo y se pondrán turbios. La proporción de tubos inoculados que muestran crecimiento es una medida de probabilidad. Se utilizan tablas estadísticas.

Medida de la turbidez (ópticos): B. MÉTODOS INDIRECTOS: Medida de la turbidez (ópticos): En una suspensión celular, las células difractan ( o dispersan) la luz incidente en forma proporcional a su concentración. Cuando un haz de luz pasa a través de una suspensión celular, la reducción de la cantidad de luz transmitida como consecuencia de la difracción es una medida de la densidad celular. Espectrofotómetro (mide la luz transmitida) Densidad óptica: OD = Log I0 / I

Ejercicios de aplicación: Comenzando con 4 células bacterianas por mililitro en un medio rico con 1 h de fase de adaptación, y en un tiempo de generación de 20 min. ¿Cuántas células habrá en un litro de este medio en 1 h?. ¿En 2 h?. Calcule el tiempo de generación en un experimento de crecimiento en el que el medio se inocula con 5.106 células/ml de Escherichia coli y luego de 1 h de fase de adaptación, creció exponencialmente durante 5 h, siendo entonces la población de 5,4 .109 células/ml.