Proteínas Bioquímica, CHEM 4220 Universidad Interamericana de PR

Presentación del tema: "Proteínas Bioquímica, CHEM 4220 Universidad Interamericana de PR"— Transcripción de la presentación:

1 Proteínas Bioquímica, CHEM 4220 Universidad Interamericana de PR
Recinto de Bayamón Prof. J. Roberto Ramirez Vivoni Prof. Alberto L. Vivoni Alonso Versión 2014

2 Funciones de proteínas
Enzimas Anticuerpos de transporte Regulatorias Estructurales de movimiento

3 Clasificación de proteínas
Globulares - estructura tridimensional. Ej. Enzimas, hemoglobina, insulina, caseina Fibrosas –estructuras de 1 ó 2 dimensiones (fibras o láminas) Ejemplos: queratinas (pelo, uñas), miosinas (músculos), colágeno (tejido conectivo) Conjugadas – Contienen grupos prostéticos (un grupo no-amino adicional) Transmembranales– atraviesan la membrana celular Glucoproteínas - Se encuentran en la membrana y actuan en reconocimiento y secreción Lipoproteínas – complejos tipo micelas que transportan triglicéridos y colesterol en la sangre.

4 Levels of structure

5 Angulos f y y

6 Ramachandran Plots

7 Preguntas Cuando f = 180° y y = 0°, ¿qué grupos tendrían interferencia estérica? ¿Se esperaría que una hélice “right handed” fuese estable con ángulos f y y de -57° y -47° respectivamente? ¿Y si fuesen 82° y -105°?

8 Láminas plegadas b: paralelas y anti-paralelas

9 Puentes de hidrógenos de láminas b

10 Hélices a

11 Puentes de H en hélices a

12 Características estructurales de las hélices a
El oxígeno de cada carbonilo está unido por puente H con un H amído que queda 4 aminoácidos alejado. Cada vuelta cubre 5.4 Å, y posee 3.6 aminoácidos. Los grupos R quedan hacia afuera.

13 Cálculo de hélice a Determine la longitud (en Angstroms*) de una pieza con contiene 8 aminoácidos. *1 Angstrom = metros

14 Estructuras 2°: helice, láminas y conectores

15 Ejemplo de proteínas fibrosas: colágeno

16 Características estructurales de colágeno
Repetición de -Gly-X-Y- Gly y Pro componen aproximadamernte 30% y 20% respectivamente Cada vuelta de la hélice cubre 0.94 nm y posee 3.0 aminoácidos. Pregunta: ¿Cuántos aminoacidos hay 3.2 nm de longitud de una hélice de colágeno?

17 Estructura 3° de mioglobina

18 Estructura 4° de Hemoglobina

19 Posición de los aminoácidos en las estructuras de proteínas
Se encuentran hacia la superficie de las proteínas Se encuentran hacia el centro de las proteínas Favorecen formación de helices a Desfavorecen la formación de helices a Favorecen la formación de laminas b Se encuentran en alto porcentaje en proteínas fibrosas Polares y con carga No-polares Sin carga, hidrofóbicos: Ala, Leu, Met, Val, Phe Pro, Gly, Tyr, Asn, Trp, Ile cadenas laterales con carga, voluminosas y contínuas Cadenas laterales pequeñas: Gly, Ala Gly, Pro, Ala

20 Preguntas A pH 7.4, en qué parte (centro o superficie) de una proteína globular se encontrarían los siguientes residuos: Ser, Glu, Thr, Phe, His, Val, Asn, Leu, Cys. Prediga cual sería la estructura de polipéptidos con las siguientes segmentos repetitivos: a) Poli(Gly-Ala-Gly-Thr) b) Poli(Glu-Ala-Leu-His) 3. Explique porqué el polipéptido poli-L-Glu forma hélices a a pH 2 pero no a pH 7.

21 Termodinámica de Proteínas: Energía libre de Gibbs
DG = DH – TDS Criterio de espontaneidad DG < 0: espontáneo DG > 0: no-espontáneo DG = 0; equilibrio

22 Relación entre DG, DH, DS y T
Especifique las temperaturas a las que las siguientes combinaciones de DH y DS propiciarían procesos espontáneos. +DH -DH +DS -DS

23 Procesos termodinámicos de proteínas
DH DS Doblamiento Solubilidad Dimerización Metabolismos Interacción ligando-receptor

24 DG y equilibrio Calcule K para una reacción de dimerización
con los datos en la tabla y la ecuación: DG = -RTlnK 2 monómeros ↔ dímero T(°C) DH(kJ/mol) DS(kJ/mol) DG(kJ/mol) 4 1.0 24 45 0.0157

25 Fuerzas que mantienen estructuras 3° y 4°
Fuerzas London (van der Waals) entre grupos R que son no-polares e hidrofóbicos. Puentes H entre grupos R polares. Puentes salinos entre aminoácidos de carga opuesta Puentes disulfuros entre cisteinas (cistina)

26 Desnaturalización de proteínas
Temperatura pH solventes orgánicos y detergentes metales pesados estres mecánico

27 Efecto de temperatura Coagulación - cuando las hebras desnaturalizadas se entrelazan y se hacen insoluble

28 Efecto de temperatura en enzimas

29 Efecto de pH

30 Desnaturalización por ácido o base

31 Desnaturalización por alcohol

32 Desnaturalización por agentes reductores

33 Separacion/purificacion y caracterización
Caracteristicas físicas Técnica experimental Tamaño Solubilidad Carga Polaridad Diálisis Filtración en gel Ultracentrifugación Espectrometría de masa Precipitación Electroforesis Intercambio iónico 4. Cromarografía de adsorción

34 Peso molecular Mr o MW (Molecular Weight): masa molecular relativa a 1/12 la masa de carbono (sin dimensiones) MM (Masa Molar): masa de 1 mol (g) Masa Molecular: Masa actual en unidades de masa atómica (dalton: Da, kDa, 1 Da = 1.66x10-24 g)

35 Preguntas Se encontró que una proteína que contiene el grupo hemo es 0.426% Fe por peso. Cuál es su masa molecular mínima? Treonina constituye 1.8% por peso de contenido de aminoácido de insulina. Cuál es la masa mínima de insulina si hay una treonina por molécula de insulina? Una proteína contiene 0.326% por peso de Fe. Cuál es su masa molecular?

36 Masa aproximada De acuerdo a la proporción de aminoácidos en la mayoría de las moléculas, la masa promedio de un residuo es 110 Da. Cuál es la masa molecular aproximada de citocroma c el cual tiene 104 residuos y un grupo hemo (Mr=412)?

37 Separacion por peso/tamaño
Diálisis Filtración en gel

38 Pregunta ¿En qué orden emergerían las siguientes proteínas en una columna de filtración-gel cuya matriz de gel tiene poros de ~200,000: mioglobulina (Mr = 16,000), catalasa (Mr = 500,000), citocroma c (Mr = 12,000), quimotripsinógeno (Mr = 26,000) y hemoglobina (Mr=66,000).

39 Ultracentrífugación

40 Ultracentrifugación analítica
Ecuación de Svedberg MM = RTs/D(1-m0) s: coeficiente de Svedberg (s) R: constante universal de gases (J/Kmol, J: kgm2/s2) T: temperatura (K) D: difusión (m2/s) m0: fracción de masa de solvente desplazada

41 Pregunta Calcule la masa de una proteína con los siguientes datos experimentales: s = 4.2 x s D = 1.2 x m2/s mo = 0.719

42 Solubilidad Control de precipitación:
Controlando el pH: las proteínas son menos solubles cuando el pH del medio es igual a su pI Aumentando la polaridad del medio Aumentando la no-polaridad del medio

43 Electrophoresis* *pH dependent

44 Pregunta En qué dirección se moverían las siguientes moléculas en un campo eléctrico a los pH indicado? Albúmina (pI= 4.9) a pH 8.0 Ureasa (pI=5.0) a pH 3.0 y 9.0 Ribonucleasa (pI=9.5) a ph 4.5, 9.5 y 11.0 Pepsina ((pI=1.0) a pH 3.0, 7.0 y 9.5 Hemoglobina A tiene un pI = 6.9. Una variante, hemoglobina M, tiene un residuo de glutamato en la posición 67 en vez de valina. Qué efecto tiene esta sustitución en el comportamiento electroforético a pH 7.5.

45 Cromatografía Papel Capa fina Intercambio iónico
Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)

46 Intercambio iónico Intercambio anónico: intercambian aniones
Intercambio catiónico: intercambian cationes

47 Pregunta Una solución de albumina de huevo (pI = 4.6), b-lactoglobulina (pI = 5.2) y quimotripsinógeno (pI = 9.5) se introducen a una columna de cromatografía de intercambio iónico compuesta de un grupo amonio con carga positiva a un pH de 5.4. La columna luego se eluyó con un amortiguador de 5.4 con un aumento en la concentración salina. ¿En qué orden saldrían estas proteínas de la columna y porqué?

48 Pregunta Ovalbúmina (pI=4.6), ureasa (pI=5.0) y mioglobina (pI=7.0) se agregan a una columna de intercambio iónico con una resina con carga positiva a un pH de 6.5. La columna luego se eluye con un amortiguador de 6.5 con un aumento en concentración de NaCl. En qué orden salen las proteínas de la columna?

49 Caracterización Peso molecular: Estructura: Espectrometría de masa
Ultracentrigufugación analítica Estructura: Rayos X Resonancia magnética nuclear (“NMR”) Dichroismo circular