Enzimas.

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1 Enzimas

2 ¡¡aumentan la velocidad 103 a 1020 veces!!
Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza proteica (catalizan reacciones bioquímicas que de otro modo se llevarían a cabo a velocidades extremadamente lentas) ¡¡aumentan la velocidad 103 a 1020 veces!! - Como catalizadores, las enzimas actúan en pequeña cantidad y se recuperan indefinidamente. - No llevan a cabo reacciones que sean energéticamente desfavorables. - No modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino que aceleran su consecución.

3 NOMENCLATURA Antiguamente las enzimas fueron nombradas atendiendo al compuesto sobre el que actuaban, añadiéndole el sufijo -asa o haciendo referencia a la reacción catalizada. Así tenemos: ureasa, cataliza la hidrólisis de la urea amilasa, la hidrólisis del almidón lipasa, la hidrólisis de lípidos ADNasa, la hidrólisis del ADN ATPasa, la hidrólisis del ATP, etc.

4 Tipo Reacción que cataliza Esquema
Clasificación En la actualidad, se ha adoptado una clasificación y nomenclatura sistemática, en la que cada enzima tiene un número de clasificación. Tipo Reacción que cataliza Esquema 1. Oxidorreductasas Transferencia de electrones (oxido reducción) 2. Transferasas Transferencia de grupos funcionales 3. Hidrolasas Reacciones de hidrólisis 4. Liasas Adición a dobles enlaces 5. Isomerasas Reacciones de isomerización 6. Ligasas o sintetasas Formación de enlaces con Hidrólisis de ATP .

5 Enzimas: Características
Son proteínas globulares. Están plegadas formando un surco o bolsillo en el que encajan la molécula o las moléculas reactivas (el sustrato) y donde tienen lugar las reacciones. Esta región del enzima se conoce como sitio activo. El sustrato se une al sitio activo mediante interacciones débiles como son: puentes de hidrógeno, electrostáticas, hidrófobas. Tienen pesos moleculares que oscilan entre y un millón. Muchas son estereoespecificas (solo actúan sobre un isómero) Algunas son proteinas conjugadas (necesitan una porción no proteica)

6 Enzimas: estereoespecificidad
La acción de la enzima es extremadamente selectiva sobre un substrato específico. (tripsina solo corta el enlace peptidico en Lys o Arg) COO- C-H H-C H3+N-C-H C-H2 + N H3+ Fumarato (= ,trans) Aspartasa L-Aspartato D-Aspartato Maleato (= ,cis) H-C- NH3+

7 Enzimas que dependen de un cofactor
Una enzima conjugada completa se denomina holoenzima, y está formada por una parte proteica (apoenzima) y un cofactor no proteico (coenzima) HOLOENZIMA = APOENZIMA + COENZIMA

8 Enzimas que dependen de un cofactor
La actividad optima de algunas enzimas depende de la cooperación de sustancias no proteicas Existen dos categorías de cofactores: Inorgánicos: incluyen iones simples como Zn2+, Mg2+, Fe2+, Cu2+, K+, Na+ Orgánicos: denominados generalmente coenzimas. Tienen un significado especial en la nutrición de los mamíferos ya que la mayoría son derivados de vitaminas o las mismas vitaminas El papel del cofactor es: 1- Alterar la estructura tridimensional de la proteína o la unión con el substrato o ambas 2- Participar en la reacción como otro sustrato (gralmente para coenzimas)

9 Enzimas que dependen de un cofactor
La actividad optima de algunas enzimas depende de la cooperación de sustancias no proteicas

10 Enzimas que dependen de un cofactor
La actividad optima de algunas enzimas depende de la cooperación de sustancias no proteicas

11 Enzimas que dependen de un cofactor
La actividad optima de algunas enzimas depende de la cooperación de sustancias no proteicas La coenzima compensa las transformaciones sufridas por el sustrato

12 Enzimas que dependen de un cofactor
La actividad optima de algunas enzimas depende de la cooperación de sustancias no proteicas La coenzima compensa las transformaciones sufridas por el sustrato

13 Coenzimas Adenosine Triphosphate (ATP) Coenzyme A (CoA)
Flavin Adenine Dinucleotide (FAD) Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate (NADP+) Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD+)

14 Coenzimas Formas oxidada y reducida de NAD (y NADP). El anillo en rojo se reduce por la adicion de un ion hidruro al C-4

15 Modo de acción de las enzimas
Modelos sobre la forma en que el sustrato se une al centro activo del enzima: Modelo llave cerradura Supone que la estructura del sustrato y la del centro activo son complementarias, de la misma forma que una llave encaja en una cerradura. Este modelo es válido en muchos casos, pero no es siempre correcto.

16 Modo de acción de las enzimas
Modelos sobre la forma en que el sustrato se une al centro activo del enzima: Modelo del ajuste inducido el sitio activo adopta la conformación idónea sólo en presencia del sustrato. La unión del sustrato al centro activo del enzima desencadena un cambio conformacional que da lugar a la formación del producto. Sería algo así como un cascanueces, que se adapta al contorno de la nuez

17 Propiedades de las enzimas
Las propiedades de los enzimas derivan del hecho de ser proteínas y de actuar como catalizadores. Como proteínas, poseen una conformación natural más estable que las demás conformaciones posibles. Así, cambios en la conformación suelen ir asociados en cambios en la actividad catalítica. Los factores que influyen de manera más directa sobre la actividad de un enzima son: pH temperatura cofactores

18 EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. Este es el llamado pH óptimo. Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína, los seres vivos han desarrollado sistemas más o menos complejos para mantener estable el pH intracelular: Los amortiguadores fisiológicos.

19 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser proteínas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama temperatura óptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reacción debido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse

20 Una enzima es un catalizador que acelera la velocidad
de una reacción quimica Modo de acción de los catalizadores Perfil energético de una reacción espontánea Perfil energético de una reacción catalizada Reacción catalizada Energía de activación La acción de los catalizadores consiste en disminuir la energía de activación (Ea ) Reacciones espontáneas: G < 0

21 Modo de acción de las enzimas
La enzima (E), se combina con el substrato (S) formando el complejo de transición, enzima-substrato (E-S), mediante una reacción reversible, cuya energía de activación es menor que la de la reacción no catalizada. Cuando se forma el producto de la reacción (P), se regenera de nuevo la enzima (E) de forma libre, la que puede combinarse de nuevo con otra molécula de substrato (S). E + S  ES  E + P

22 CINÉTICA ENZIMÁTICA La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especificidad de la enzima La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.

23 Método de las velocidades iniciales:
CINÉTICA Método de las velocidades iniciales: Consiste en medir la velocidad inicial de la reacción (v0) para diferentes concentraciones. v0 = pendiente de la curva de avance a tiempo cero. Condiciones Mediciones antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, ([S]= constante a lo largo del experimento.) Además, en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad.

24 CINÉTICA ENZIMÁTICA La primera clave en cuanto al comportamiento enzimáticos lo aportaron Henri (1903) y Michaelis y Menten (1913). Durante su trabajo observaron que cuando mantenían constante E y variaban la S obtenian una relacion hiperbolica entre la velocidad y la S Cinética de orden 0 v = k Cinética de orden 1 v = k S Propusieron entonces describir la grafica hiperbólica como una transición entre una cinética de orden 1 a 0

25 CINÉTICA ENZIMÁTICA Cuando [S]0 es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden. A altas [S]0, la enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]0. En este punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es máxima (Vmax).

26 E + S  ES  E + P MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN
Las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: 1- Formación del complejo enzima-sustrato (ES) 2- El complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto, liberando el enzima libre (E + P) k2 k3 E + S  ES  E + P k1

27 Relación entre v0 y la concentración de sustrato
Ecuación de Michaelis-Menten: Relación entre v0 y la concentración de sustrato Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten. Se dice que su cinética no es Michaeliana. Esto ocurre con los enzimas alostéricos, cuya gráfica v frente a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide (Figura de la derecha). En la cinética sigmoidea, pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reacción.

28 Significado de la constante de Michaelis-Menten (KM)
1- KM es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. En efecto, si KM = [S], la ecuación de Michaelis-Menten se reduce a: v = Vmax/2. El valor de KM da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: a menor KM, mayor afinidad del enzima por el sustrato a mayor KM, menor afinidad. Los valores de KM de muchos enzimas son próximos a los de la concentración fisiológica de sus sustratos, de forma que pequeñas variaciones en la [S] pueden suponer grandes cambios en la velocidad de toda una ruta metabólica.

29 Significado de la constante de Michaelis-Menten (KM)
La cantidad de glucosa requerida para el 50% de la saturación es 1000 veces menor que la requerida para alosa. La enzima es mas eficiente para glucosa y para manosa

30 Significado de la velocidad máxima (Vmax)
k2 k3 E + S  ES  E + P Significado de la velocidad máxima (Vmax) 1- Es la expresión de la eficiencia del funcionamiento enzimático. Sin embargo, resulta mas conveniente expresar la eficiencia en términos de la cantidad molar de cada enzima: la ACTIVIDAD MOLECULAR O NÚMERO DE RECAMBIO DE LA ENZIMA que representa los moles de sustrato transformado por mol de enzima por unidad de tiempo k1 Ejemplo: Un ensayo tipo Michaelis-Menten en condiciones optimas (pH próximo a 7 y T: 35-37ºC) muestra que 1g de la enzima presenta una Vmax de 1.2 x 10-3 moles de CO2 transformados por minuto. El PM de la enzima es 30000; por lo tanto 1g representa: /30000 moles de enzima = 3.3 x moles, entonces:

31 CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA
La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (v0 frente a [S]0) es una hipérbola La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax.

32 CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA
Para determinar gráficamente los valores de KM y Vmax es más sencillo utilizar la representación doble recíproca (1/v0 frente a 1/[S]0), ya que es una línea recta. Esta representación doble recíproca recibe el nombre de representación de Lineweaver-Burk Es una recta en la cual: La pendiente es KM/Vmax La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/KM La ordenada en el origen (1/[S]0 = 0) es 1/Vmax De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular gráficamente, los valores de KM y Vmax de un enzima para diversos sustratos.

33 CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA
En el estudio de la actividad catalítica de una enzima se obtuvieron los siguientes datos experimentales, a partir de los cuales deben determinarse los valores de KM y Vmax Rta: KM :2.27 mM y Vmax: 0.51 mg/min S (mM) Producto formado (mg/min) 1.5 0.21 2.0 0.24 3.0 0.28 4.0 0.33 8.0 0.40 16 0.45

34 Inhibición enzimática
Algunos antibióticos, medicamentos quimioterapéuticos, insecticidas y herbicidas son sustancias que interfieren en el funcionamiento de enzimas específicas. En las células naturalmente se producen inhibiciones de enzimas lo que se conoce como biorregulación. Los inhibidores pueden unirse reversible o irreversiblemente a las enzimas. Los inhibidores irreversibles se unen covalentemente a residuos aminoacídicos de la enzima impidiendo su acción. Este es el efecto de Hg+2, Pb+2 , los gases neurotóxicos y los compuestos arsenicales. Los inhibidores reversibles se unen a la enzima por el mismo tipo de interacciones que se producen entre las enzimas y los sustratos y dentro de ellos se encuentran los inhibidores competitivos y no competitivos. Casos 1- Competitiva 2- No competitiva 3- Irreversible

35 Inhibición enzimática competitiva
El inhibidor competitivo tiene generalmente una estructura similar a la del sustrato. El complejo EIcomp no da productos y disminuye el número de moléculas de E libres en condiciones de interaccionar con el S. sitio activo Sustrato inhibidor E ES ¿Cómo se detecta? Se mide v0 en función de S en presencia y ausencia de I Tanto el sustrato como el inhibidor pueden unirse al sitio activo productos el inhibidor evita la unión del sustrato al sitio activo EI No se afecta la Vmax pero KM tiene un valor mayor

36 Inhibición enzimática competitiva
El Inhibidor es análogo químicamente al sustrato Tanto el sustrato como el inhibidor pueden unirse al sitio activo Bezamidina inhibe a tripsina..

37 Inhibición enzimática no competitiva
Cuando el efecto de una sustancia inhibidora no se puede revertir aumentando la [S], el inhibidor es no competitivo. EL I se une a un sitio distinto al sitio activo y por eso puede formarse el complejo enzima-sustrato-inhibidor (EIS) que no da productos. La presencia del I actúa como si disminuyera la [E] presente y por eso nunca se llega a la Vmax por más que se aumente la [S]. Las moléculas de E libre que están en condiciones de actuar y dar producto, se comportan como si no hubiera inhibidor y por eso KM no varía. sitio activo La unión del inhibidor distorsiona la enzima S I E sitio del inhibidor EI el sustrato y el Inhibidor pueden unirse al sitio activo simultáneamente EIS En ausencia del inhibidor procede la formación del producto el inhibidor disminuye la velocidad de formación del producto Si la afinidad de S es la misma por E y EI y la afinidad de I es la misma por E y ES es una inhibición no competitiva pura Si las afinidades son diferentes cambia tanto Vmax como KM y se trata de una inhibición no competitiva mixta

38 Eventos en el sitio activo
El sitio activo contiene residuos de aminoácidos que participan directamente en la producción y ruptura de los enlaces. Estos residuos se denominan grupos catalíticos. Aunque las enzimas difieren ampliamente en estructura, especificidad y modo de acción se pueden establecer algunas generalizaciones: Sitio activo son hoyos o hendiduras (microambientes) es una pequeña porción del volumen total de la E su disposición en cuanto a los átomos determina la especificidad de la enzima (llave-cerradura, etc) la unión ES ocurre por numerosas fuerzas debiles es una entidad tridimensional formada por grupos laterales de los aminoácidos de la proteína

39 Eventos en el sitio activo
¿Quiénes son estos residuos catalíticos responsables de la actividad de las enzimas? Son aminoácidos con cadenas laterales químicamente reactivas serina treonina cisteina ácido aspártico ácido glutámico lisina arginina tirosina histidina Serina Treonina Cisteina Ácido Aspártico Ácido Glutámico

40 Eventos en el sitio activo
¿Cómo operan estos residuos catalíticos? 1- Catálisis por tensión de enlace: Las interacciones entre los grupos R de las proteínas y el sustrato originan perturbaciones en los ángulos de enlace o la longitud de la molécula de Sustrato 2- Catálisis ácido-base: los grupos R pueden actuar como donores o aceptores de protones (ácidos o bases de Bronsted) o electrones (ácidos o bases de Lewis) 3- Catálisis por orientación: los grupos R y el sustrato están en una orientación optima para reaccionar unos con otros

41 Eventos en el sitio activo
Carboxipeptidasa A actúa sobre el extremo carboxilo terminal de los polipéptidos (se utiliza para determinar la secuencia de manera similar a la tripsina) Consta de 307 residuos de aac, su PM es contiene Zn2+ como cofactor residuos catalíticos polinucleótido La ruptura C-N ocurre debido a un aumento en la polarización del enlace C=O debido a la influencia el Zn2+ y la donación de protones de tirosina, entre otros eventos cofactor

42 ESPECIFICIDAD ENZIMATICA
La especificidad de las enzimas es una consecuencia del alto grado de organización del sitio activo (secuencia de aminoacidos) Tipos de especificidad Absoluta cada E cataliza solo una reacción Relativa pueden catalizar el mismo tipo de reacción con mas de un sustrato similar Sitio activo altamente ordenado y rígido. (Modelo llave cerradura) Sitio activo flexible, puede sufrir ligeras modificaciones (Modelo del encaje inducido)

43 Estereoespecificidad
La enzima “distingue” o “reconoce” grupos quimicos identicos (estereoisomeros)