BIOQUÍMICA Enzimología.

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1 BIOQUÍMICA Enzimología

2 Enzimología Generalidades. Clasificación.
Modo de acción de las enzimas. Cinética de las reacciones simples catalizadas por enzimas. Ecuación de Michaelis-Menten. Actividad enzimática. Unidades. Cuantificación de la actividad enzimática. Coenzimas. Factores que afectan la cinética enzimática. Inhibidores enzimáticos. Regulación de la catálisis enzimática.

3 Las enzimas son proteínas altamente especializadas que tienen como función la catálisis o regulación de la velocidad de las reacciones químicas que se llevan a cabo en los seres vivos. E + P E + S [ES]

4 Las enzimas son proteínas* que catalizan reacciones químicas
No hacen factibles las reacciones imposibles Son sustancias que, sin consumirse en una reacción, aumentan notablemente su velocidad. Ello hace posible que en condiciones fisiológicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requerirían condiciones extremas de presión, temperatura o pH. Prácticamente todas las reacciones químicas que tienen lugar en los seres vivos están catalizadas por enzimas. * En su mayoría son proteínas, hay ARN con capacidad catalítica (ribozimas)

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6 Aspectos generales de las enzimas
Las enzimas son catalizadores específicos: cada enzima cataliza un solo tipo de reacción, y casi siempre actúa sobre un único sustrato o un grupo muy reducido de ellos. Sustrato: sustancia sobre la que actúa la enzima

7 Formación de productos
Reacción catalizada por una enzima: centro activo región concreta de la enzima donde el sustrato se une Enzima y su sustrato Unión al centro activo Formación de productos E + S  ES  E + P Complejo enzima-sustrato

8 El centro activo comprende
un sitio de unión formado por los aminoácidos que están en contacto directo con el sustrato y un sitio catalítico, formado por los aminoácidos directamente implicados en el mecanismo de la reacción

9 El sustrato se une a la enzima luego se inicia la catálisis
Sitio de unión: es el que le da la especificidad a la enzima Sitio catalítico

10 Nomenclatura Hay varias formas de nombrar una enzima: nombres particulares nombre sistemático código de la comisión enzimática (enzyme comission)

11 Nomenclatura: nombres particulares
Antiguamente, los enzimas recibían nombres particulares, asignados por su descubridor. Ejemplos: amilasa (hidrolisa el almidón) glucoquinasa Glc + ATP  Glc-6P + ADP Al ir aumentando el número de enzimas conocidos, se hizo necesaria una nomenclatura sistemática que informara sobre la acción específica de cada enzima y los sustratos sobre los que actuaba.

12 Nomenclatura: nombre sistemático
Consta actualmente de 3 partes: el sustrato preferente el tipo de reacción realizado terminación "asa" ejemplo: la glucoquinasa ATP:glucosa fosfo transferasa Glc + ATP  Glc-6P + ADP

13 Nomenclatura: Comisión de Enzimas
El nombre es identificado por un código numérico: encabezado por las letras EC (enzyme commission) seguidas de cuatro números separados por puntos. el primer número indica a cual de las seis clases pertenece la enzima, el segundo se refiere a distintas subclases dentro de cada grupo, el tercero y el cuarto se refieren a los grupos químicos específicos que intervienen en la reacción.

14 Nomenclatura: Comisión de Enzimas
Ej.: la ATP:glucosa fosfotransferasa (glucoquinasa) Glc + ATP  Glc-6P + ADP EC 2: transferasa 7: fosfotransferasa 1: el aceptor es un grupo OH 2: es un OH de la D-glucosa el que acepta el grupo fosfato.

15 Nomenclatura: Comisión de Enzimas
Clases Óxido-reductasas Transferasas Hidrolasas Liasas Isomerasas Ligasas

16 Clase 1: OXIDORREDUCTASAS Catalizan reacciones de transferencia de hidrógeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a otro AH2 + B ⇄ A + BH2 Ared + Box ⇄ Aox + Bred

17 Clase 2: TRANSFERASAS Catalizan la transferencia de un grupo químico (distinto del hidrógeno) de un sustrato a otro A-B C ⇄ A + C-B

18 Clase 3: HIDROLASAS Catalizan las reacciones de hidrólisis
A-B H2O ⇄ AH + B-OH

19 Clase 4: LIASAS Catalizan reacciones de ruptura o unión de sustratos
A-B ⇄ A + B

20 Clase 5: ISOMERASAS Catalizan la interconversión de isómeros
⇄ B Fosfoglucosa isomerasa EC 5.

21 Clase 6: LIGASAS Catalizan la unión de dos sustratos con hidrólisis simultánea de un nucleótido trifosfato (ATP, GTP, etc.) A + B + XTP ⇄ A-B + XDP + Pi

22 Comisión de Enzimas – página web

23 MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS
H2O  H2O O2 Perfil energético de una reacción espontánea Perfil energético de una reacción catalizada

24 MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS
La acción de los catalizadores consiste en disminuir la Energía de activación Las enzimas son catalizadores especialmente eficaces, ya que disminuyen la Ea aún más que los catalizadores inorgánicos. Por ej, la descomposición del agua oxigenada (H2O2) puede ocurrir sin catalizador Ea= 18 Kcal/mol con un catalizador inorgánico (platino) Ea= 12 Kcal/mol con una enzima específico (catalasa) Ea= 6 Kcal/mol Así, se puede calcular que el platino acelera la reacción veces, mientras que la catalasa la acelera veces.

25 MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS
Para que una reacción química tenga lugar, las moléculas de los reactantes deben chocar con una energía y una orientación adecuadas. La actuación de la enzima aumenta la concentración efectiva de los sustratos (aumenta la probabilidad de choque) permite que los reactantes (sustratos) se unan a su centro activo con una orientación óptima para que la reacción se produzca y modifica las propiedades químicas del sustrato unido a su centro activo, debilitando los enlaces existentes y facilitando la formación de otros nuevos

26 Modelo Llave-Cerradura

27 MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS
Hay dos modelos sobre la forma en que el sustrato se une al centro activo del enzima: el modelo llave-cerradura el modelo del ajuste inducido

28 MODELO LLAVE-CERRADURA
La estructura del sustrato y la del centro activo son complementarias Este modelo es válido en muchos casos, pero no es siempre correcto

29 MODELO DEL AJUSTE INDUCIDO
el centro activo adopta la conformación idónea sólo en presencia del sustrato. La unión del sustrato al centro activo del enzima desencadena un cambio conformacional que da lugar a la formación del producto.

30 Modelo del Ajuste Inducido

31 Perfil Energético de una Perfil Energético de una
Reacción Espontánea Perfil Energético de una Reacción Catalizada

32 Cofactores - Coenzimas
A veces, un enzima requiere para su función la presencia de sustancias no proteicas que colaboran en la catálisis: los cofactores. Pueden ser iones inorgánicos como el Fe++, Mg++, Mn++, Zn++ etc. Casi un tercio de los enzimas conocidos requieren cofactores. Cuando el cofactor es una molécula orgánica se llama coenzima.

33 Cofactores - Coenzimas
Muchas de estas coenzimas se sintetizan a partir de vitaminas. Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente al enzima se llaman grupos prostéticos. La forma catalíticamente activa del enzima, es decir, el enzima unida a su grupo prostético, se llama holoenzima. La parte proteica de un holoenzima (inactiva) se llama apoenzima, de forma que: apoenzima + grupo prostético= holoenzima

34 Coenzima: NAD+ Deriva de la Vitamina B5 (ácido nicotínico)

35 Coenzima: FAD Es grupo prostético Deriva de la Vitamina B2 (flavina)
FAD forma oxidada FADH2 forma reducida

36 CLASE 1: OXIDOREDUCTASAS

37 Clase 2: TRANSFERASAS Catalizan la transferencia de un grupo químico (distinto del hidrógeno) de un sustrato a otro, según la reacción: A-B + C A + C-B

38 A-B + H2O AH + B-OH Clase 3: HIDROLASAS LACTASA lactosa + agua
glucosa + galactosa lactosa + agua LACTASA

39 Acetato Descarboxilasa
Clase 4: LIASAS A + B A-B CO2 + Acetona Ácido acético Acetato Descarboxilasa

40 Clase 5: ISOMERASAS Fosfotriosaisomerasa

41 A-B + XDP + Pi A + B + XTP Clase 6: LIGASAS Oxaloacetato + ADP + Pi
Piruvato Carboxilasa Oxaloacetato + ADP + Pi Piruvato + CO2 + ATP

42 CINÉTICA ENZIMÁTICA La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. La velocidad de una reacción catalizada por una enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar la enzima. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especifidad de la enzima.

43 CINÉTICA ENZIMÁTICA MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN
Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración inicial del sustrato sobre la actividad enzimática comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta teoría y propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de los enzimas.

44 MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN
v = v3 = k3 [ES] = V = velocidad de la reacción catalizada por la enzima

45 MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA
= v3 = k3 [ES] =             V = velocidad de la reacción catalizada por la enzima

46 MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA
= v3 = k3 [ES] =             La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten es una hipérbola . La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax.

47 MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA
Para determinar gráficamente los valores de KM y Vmax es más sencillo utilizar la representación doble recíproca (1/v0 frente a 1/[S]0), ya que es una línea recta. Esta representación doble recíproca recibe el nombre de representación de Lineweaver-Burk

48 El valor de KM da idea de la afinidad del enzima por el sustrato:
La constante de Michaelis-Menten (KM) es un parámetro cinético importante por varias razones: KM es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. El valor de KM da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: a menor KM, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor KM, menor afinidad.

49 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: se mide en términos de velocidad
UI: los µmoles de sustrato que la enzima transforma en un minuto. Katal: los moles de sustrato que la enzima transforma en un segundo Cuando se conoce el PM E pura y el número de centros activos por molécula de enzima, las medidas de actividad enzimática permiten calcular el número de recambio: número de moles que la enzima convierte por cada centro activo y por unidad de tiempo.

50 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: se mide en términos de velocidad
La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.

51 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: se mide en términos de velocidad
La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos. - A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción - Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v0). - La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero - De esta forma, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento. vo

52 Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representamos v0 frente a [S]0 obtenemos una gráfica Cuando [S]0 es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden. A altas [S]0, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]0. En este punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es máxima (Vmax).

53 Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten
Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten. Se dice que su cinética no es Michaeliana. Esto ocurre con las enzimas alostéricos, cuya gráfica v frente a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide En la cinética sigmoidea, pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reacción.

54 Factores que afectan la cinética enzimática
La actividad puede estar afectada por: el pH la temperatura la fuerza iónica Inhibidores

55 Efecto del pH Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. Este es el llamado pH óptimo.

56 La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH.
Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína, los seres vivos han desarrollado sistemas más o menos complejos para mantener estable el pH intracelular Efecto el pH

57 Efecto de la Temperatura

58 Factores que afectan la cinética enzimática: INHIBIDORES
Ciertas moléculas pueden inhibir la acción catalítica de un enzima: son los inhibidores. Irreversibles E + I  EI se unen fuertemente a la E y el complejo no se disocia Reversibles E + I ⇄ EI

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60 Inhibidores Reversibles
Pueden actuar de 3 modos: ocupan temporalmente el centro activo por semejanza estructural con el sustrato original: inhibidor competitivo alteran la conformación espacial del enzima, impidiendo su unión al sustrato: inhibidor no competitivo Se unen al complejo E-S impidiendo la catálisis del sustrato: inhibidor acompetitivo

61 Inhibidores Reversibles inhibidor competitivo

62 Inhibidores Reversibles inhibidor no competitivo

63 Inhibidores Reversibles inhibidor acompetitivo

64 Inhibidores Reversibles inhibidor acompetitivo

65 Regulación de la catálisis enzimática
las concentraciones del sustrato y de los productos finales presencia de inhibidores modulación alostérica modificación covalente activación por proteolisis (zimógenos) isoenzimas

66 EFECTO DE LAS CONCENTRACIONES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
La velocidad de una reacción enzimática depende de la concentración de sustrato. Además, la presencia de los productos finales puede hacer que la reacción sea más lenta, o incluso invertir su sentido

67 MODULACIÓN ALOSTÉRICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Hay enzimas que pueden adoptar 2 conformaciones interconvertibles llamadas R (relajada) y T (tensa). R es la forma más activa porque se une al sustrato con más afinidad. Las formas R y T se encuentran en equilibrio R <==> T

68 MODULACIÓN ALOSTÉRICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Ciertas sustancias tienden a estabilizar la forma R. Son los llamados moduladores positivos. El propio sustrato es a menudo un modulador positivo. Las moléculas que favorecen la forma R pero que actúan sobre una región del enzima distinta del centro activo son los activadores alostéricos (modulador alostérico positivo)

69 MODULACIÓN ALOSTÉRICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Las sustancias que favorecen la forma T y actúan en lugares distintos del centro activo de la enzima y disminuyen la actividad enzimática: son los moduladores alostéricos negativos.

70 enzimas alostéricas, no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten, la gráfica v frente a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide En la cinética sigmoidea, pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reacción.

71 Regulación de la actividad enzimática por MODIFICACIÓN COVALENTE
Hay enzimas que pasan de la forma inactiva a la activa uniéndose covalentemente a un grupo químico de pequeño tamaño como el Pi o el AMP. También se da el caso inverso El enzima no fosforilado es inactivo El enzima fosforilado es activo

72 Regulación de la actividad enzimática por ACTIVACIÓN PROTEOLÍTICA
Algunos enzimas no se sintetizan como tales, sino como proteínas precursoras sin actividad enzimática. Estas proteínas se llaman proenzimas o zimógenos. Para activarse, los zimógenos sufren un ataque hidrolítico que origina la liberación de uno o varios péptidos. El resto de la molécula proteica adopta la conformación y las propiedades del enzima activo. Ej.: enzimas digestivos se secretan en forma de zimógenos y en el tubo digestivo se convierten en la forma activa. Es el caso de la quimotripsina, que se sintetiza en forma de quimotripsinógeno

73 Regulación de la actividad enzimática por ACTIVACIÓN PROTEOLÍTICA

74 REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR MEDIO DE ISOENZIMAS
Algunos enzimas tienen distinta estructura molecular aunque su función biológica es similar. Se llaman isozimas o isoenzimas. Estas diferencias de estructura se traducen en ligeros cambios en sus propiedades, de forma que cada isozima se adapta perfectamente a la función que debe realizar. Así, podemos observar la existencia de isoenzimas en función de: el tipo de tejido: Por ejemplo, la lactato deshidrogenasa presenta isozimas distintos en músculo y corazón. el compartimento celular donde actúa: Por ejemplo, la malato deshidrogenasa del citoplasma es distinta de la de la mitocondria. el momento concreto del desarrollo del individuo. Ej: algunos enzimas de la glicolisis del feto son diferentes de los mismos enzimas en el adulto.