Técnicas de Pipeteo y unidad PLT

Presentación del tema: "Técnicas de Pipeteo y unidad PLT"— Transcripción de la presentación:

1 Técnicas de Pipeteo y unidad PLT
BRAND GMBH + CO KG I.Q. Verónica Nápoles - Gerente de Ventas América Central-

2 Sistemas de pipeteo y dosificación
En la actualidad, requerimos de herramientas que nos ayuden a pipetear volúmenes muy pequeños, incluso en el rango de 0,1 a 1.0 microlitro. Pipetear estos rangos de volúmenes, es una parte esencial de un AMPLIO CAMPO DE APLICACIONES. Afortunadamente, contamos con una gama extraordinaria de sistemas de pipeteo en el mercado, incluyendo pipetas de cojín de aire y desplazamiento positivo, sistemas manuales y electrónicos, así como micropipetas monocanales multicanales. Pipeteo directo o pipeteo inverso

3 Se entiende como resultado a la consecuencia final de una serie de acciones o eventos, expresados cualitativa o cuantitativamente. El no alcanzar estos resultados, puede indicar que las acciones son ineficientes o defectuosas. De ahí la importancia de la disciplina, hábitos y cultura al dar seguimiento a un procedimiento para obtener dichos resultados.

4 ¿Cuál es la mejor alternativa?
¿sigo los procedimientos al pie de la letra? ¿ material esta en condiciones adecuadas para llevar a cabo mi trabajo? ¿Cuál es la mejor alternativa?

5 Medición de volúmenes La medición de volúmenes es de importancia esencial en los laboratorios. 1.- El usuario tiene que aclarar con qué exactitud han de efectuarse las mediciones individuales. 2.- El usuario puede elegir el tipo de aparato a utilizar en el caso concreto de medición. Mediciones exactas exigen aparatos de medición exactos y un manejo correcto.

6 Las Buenas Prácticas de Laboratorio son procedimientos de organización y trabajo, bajo las cuales los estudios se planifican, realizan, controlan, registran e informan. Su OBJETIVO: es asegurar la calidad e integridad de todos los datos obtenidos durante un estudio determinado y también reforzar la seguridad. Promulgadas por OCDE (Organización de Cooperación y Desarrollo Económicos) FDA (Food and Drug Administration)

7 Buenas Prácticas de Laboratorio
Elemento: Aparatos, materiales y reactivos Los aparatos deben de ser examinados, limpiados y calibrados periódicamente, siguiendo procedimientos normalizados de trabajo, para obtener resultados confiables.

8 Pipetas de desplazamiento positivo
Pipetas con cojín de aire Pipetas de desplazamiento positivo

9 Pipetas con cojín de aire - Pipetas de desplazamiento
No hay contacto directo entre el pistón Y el líquido (interfase de aire). Recomendado donde no se permite ningún arrastre, como con medios infecciosos o radioactivos 1. 2. Desplazamiento positivo El piston tiene contacto directo con el Líquido aspirado. El émbolo movible perfectamente ajustado a los capilares, deja siempre limpias las paredes de los mismos. El desplazamiento directo permite trabajar sin contaminaciones, puesto que no se forman aerosoles 2.

10 Transferpettor Pipeta de desplazamiento directo.
Donde pipetas con cojín de aire llegan a límites naturales, destaca el valor de la pipeta Transferpettor. Pipeta de desplazamiento directo. Dos diferentes tipos de Transferpettor (digital y fijo) ideal para líquidos criticos y suspensiones densidad: 13,6 g/cm³ máx. viscosidad: 50 000 mm²/s máx. (dependiendo del tamaño de pipeta) presión de vapor: 500 mbar máx. Rango de temperatura de trabajo permitido: 15 °C a 40 °C Limitaciones de uso La cristalización de soluciones salinas concentradas y otros líquidos que cristalicen pueden dañar el émbolo.

11 Transferpettor - Ideal para pipetear líquidos de alta viscosidad y medios de alta densidad (soluciones proteínicas, aceites, resinas, grasas, glicerina, mercurio, ácido sulfúrico). - Medios que tiendan a producir espuma (tensoactivos). - Medios de alta presión de vapor (alcoholes, éter, hidrocarburos). No es necesario cambiar la punta después de cada pipeteado, ya que el residuo en las paredes de la punta es mínimo.

12 HandyStep® S y puntas PD
El HandyStep® S y las puntas PD funcionan según el principio de desplazamiento directo. Es posible dosificar líquidos de alta viscosidad, alta densidad o de alta presión de vapor con máxima precisión. El desplazamiento directo permite trabajar sin contaminaciones, puesto que no se forman aerosoles Aplicaciones: Ideal para rutina e investigación de diagnósticos, biología molecular, análisis medioambientales, y mucho más. ¡Nuevo!

13 Tabla de volúmenes Handy Step S
Tabla de volúmenes Handy Step S Settings 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 Steps 49 32 24 19 15 13 11 10 9 PD-tip ml Volumen µl 0.1 6 7 8 0.5 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90 100 1.25 37.5 62.5 75 87.5 112.5 125 150 175 200 225 250 300 350 400 450 500 600 700 800 900 1000 12.5 375 625 750 875 1125 1250 1500 1750 2000 2250 2500 3000 3500 4000 4500 5000

14 HandyStep® electrónico
Dosificación automática (AUTO-DISP) El aparato calcula el valor medio de los intervalos entre tres pasos de dosificación y sigue trabajando automáticamente con este ritmo: ¡función patentada de aprendizaje! Pipeteado (PIP) Se trabaja de igual manera que con una pipeta de desplazamiento directo. Ideal para pipetear líquidos viscosos o volátiles. Dosificación (DISP) Modo estándar Una vez aspirado el líquido, éste se dosifica repetidas veces en volúmenes parciales definidos antes por el usuario

15 Pipetas de cojín de aire

16 Modelos de Micropipetas con cojín de aire

17 Operación de una micropipeta de cojín de aire
Posición de descanso Posición de descanso 1er tope 1er tope 2do tope Presionar tecla de expulsión El pistón se mueve para abajo Soplar Expulsor de puntas se mueve hacia abajo El pistón se mueve para abajo ¡No colocar nunca el aparato con la punta llena en posición horizontal! Ya que introduciría el liquido en el interior del mismo y puede contaminarlo.

18 Técnicas de pipeteo directo
a) Presionar el botón de pipeteado hasta el primer tope. Sumergir la punta 2-3 mm en el líquido. Aspirar el líquido soltando el botón lentamente. b). Dispensar el líquido presionando el botón de pipeteado hasta el segundo tope. La punta debe tener contacto con la pared del recipiente. Gamma de ajuste Profundidad de inmersión en mm 0,1 μl - 1 μl – 2 mm > 1 μl μl mm > 100 μl μl mm > 1000 μl mm Se recomienda su uso para: Soluciones estándar como: agua, buffer, soluciones alcalinas diluidas y ácidos y bases diluidos.

19 Técnicas de pipeteo inverso
a) Presionar el botón de pipeteado hasta el segundo tope. Sumergir la punta 2-3 mm en el líquido. Aspirar el líquido soltando el boton. Se aspira un volumen mayor al mostrado en el indicador de volumen. b) Presionar el botón hasta el primer tope. Queda líquido en la punta. Se recomienda su uso para: soluciones viscosas, soluciones con una elevada presión de vapor. Al suministrar líquidos con alta presión de vapor es preferible utilizar un sistema de desplazamiento directo en lugar de pipeteo inverso

20 Puntos importantes El líquido debe ser aspirado lento y suavemente.
Presionar el primer tope siempre con la misma fuerza Cuando el líquido sea aspirando, la punta debe sumergirse solo unos mm igualdad de temperatura de la pipeta y del líquido sostener la pipeta verticalmente al aspirar usar puntas originales o adecuadas para la micropipeta humedecer las puntas 5 veces

21 ¿ En que casos podemos utilizar una micropipeta electrónica?
Se obtiene mayor precición ya que el primer tope es siempre igual Reducción de fuerzas Fuerza requerida para colocar la punta. Fuerzas para aspirar y dispensar el líquido Fuerza para soplar Fuerza requerida para expulsar la punta En Biotecnología por: Reducción en el volumen de la muestra Incremento en el número de muestras procesadas Trabajo con diversas técnicas de dosificación

22 Micropipetas electrónicas
Pipetear (Modo PIP)   Se aspira un volumen ajustado previamente y se vuelve a soltar Mezclar muestras (Modo PIPmix)   Programa para mezclar líquidos. Una muestra se   aspira y expulsa repetidamente y aparece en el   display el número de ciclos. Pipeteado inverso (Modo revPIP)   Programa especial para pipetear líquidos de gran viscosidad, alta   presión de vapor o medios espumosos. Pipetear en electroforesis (Modo GEL)   Programa para cargar geles en electroforesis. Un volumen de muestra variable se aspira a una gran velocidad modificable y se vuelve a   soltar muy lentamente. Dispensar (Modo DISP)   Programa para dispensar líquidos. Un volumen aspirado se vuelve a   soltar parcialmente en pasos. 

23 Influencia en el ángulo de
inclinación Ejemplo: Para una pipeta 100 µl con un ángulo de inclinación 60° -> DV = + 0,53 µl (teoréticamente) + 0,54 µl (experimento)

24 Factores de influencia generales
Evaporación Temperatura El volumen disminuye a causa de la evaporación. Cuanto más pequeña la humedad relativa más líquido pasa a la fase vapor. El volumen disminuye según la expansión térmica del cojín de aire. Ejemplo: Vástago arriba caliente y abajo frío – al aspirar el líquido el cojin de aire se mueve desde una región fría a una región caliente y se expande.

25 Influencia en el uso de puntas diferentes Volumen despedido
4 pipetas diferentes de 200 µl (A – D) Puntas originales (A, B, C, D) – y de otros fabricantes (X, Y, Z) falta de hermeticidad Volumen despedido Tipo de pipeta

26 Calidad de las puntas Igualdad de lote a lote
2. Hermeticidad del sistema punta/pipeta 3. Calidad de la superficie 4. Calidad de la materia prima 5. Influencia de los aditivos en la materia prima rebadas

27 Puntas de Pipeta Para los laboratorios es crucial que las puntas que se utilizan para transferir muestras líquidas no generen datos que resulten ser falsos positivos o falsos negativos. Hay una regla muy sencilla en cuanto a las técnicas de manipulación de líquidos para evitar la contaminación cruzada de un experimento a otro. Usar puntas nuevas para cada muestra, control o reactivo. NO RECICLAR. Utilice puntas con filtro para eliminar la posibilidad de que los aerosoles con contaminante, traspasen la punta y se introduzcan en el cuerpo de la pipeta.

28 Puntas de Pipeta Rango nano-cap™ 0.1 - 20 µl Punta cristal 0.5 - 20 µl
Punta neutra 1.0 – 50 µl Punta amarilla µl Punta neutra µl Punta azul µl Punta neutra µl Punta neutra µl

29 Puntas de pipeta con filtro Autoclavable
Para el empleo en la técnica PCR y para el trabajo en los campos de la microbiología y la radioactividad. Filtro de PE-hidrofóbo que funciona como una barrera contra aerosoles que se forman durante el pipeteado. Protegen los vástagos contra la contaminación. Esterilizables en autoclave.

30 Tip-Stack Tip-Rack S Tip-Box N esteril La esterilización se realiza con rayos B y cumple con la norma ISO 11137 La esterilidad corresponde con las exigencias de Ph Eur y USP25. La concentración de endotoxinas es inferior a 0,01 I.E./ml

31 Todas las puntas y puntas con filtro de hasta 1
Todas las puntas y puntas con filtro de hasta µl son: libres de ADN Libres de Rnasa Libre de endotoxinas Libre ATP Productos BIO-CERT ® también son estériles.

32 ¡Más hidrófobas que PTFE!
Puntas de baja retención Puntas y puntas con filtro ¡Más hidrófobas que PTFE!

33 Puntas de baja retención Puntas y puntas con filtro
Comparación de líquidos residuales en puntas BRAND estándar y puntas de baja retención con diferentes líquidos (puntas de 200 µl utilizadas en una Transferpette S)

34 Puntas de baja retención Puntas y puntas con filtro
Comparción de líquido residual en puntas estandar BRAND y puntas de baja retención (liquido 60 % glicerina)

35 De la micropipeta a la muestra De la muestra a la micropipeta
Contaminación Tenemos 3 fuentes principales de contaminación en nuestro sistema micropipeta-punta: De la micropipeta a la muestra De la muestra a la micropipeta De muestra a muestra Contaminación vía aerosol

36 Limpieza y descontaminación
Autoclavable a 121 °C (2 bares) y con un tiempo de exposición de como mínimo 15 minutos según DIN EN 285. Las micropipetas totalmente autoclavables deben: autoclavarse sin punta fijar el control de volumen en un punto fijo, nunca entre 2 volumenes Con el protector de cambio de volumen totalmente desbloqueado (UNLOCK). Dejar que la micropipeta se enfrie y seque completamente Después del autoclavado apretar la conexión roscada entre la empuñadura y el vástago de la pipeta.

37 Balanzas

38 Tolerancias ISO 8655

39 ISO 8655 Volumen a verificar. Volumen nominal 50% del volumen nominal
• 10 mediciones•

40 Calibración de pipetas
Condiciones de ensayo Identificación de la pipeta Igualdad de temperatura Temperatura entre 15°C y 30°C Temperatura constante ± 0,5°C Termómetro ± 0,5°C Balanza con una precisión diez veces mejor que la tolerancia de la pipeta Humedad mayor de 50% Calibración 1. Acondicionar la pipeta 2. Usar una punta nueva 3. Tarar el recipiente de pesar 4. Humedecer la punta una vez 5. Aspirar el agua sujetando la pipeta verticalmente y sumergiendo la punta mm 6. Escurrir la pipeta a lo largo de mm en la pared del recipiente 7. Repetir 9 veces. Ensayo en 100%, 50 %; 10 % Evaluación y documentación

41 Calibración (examinación de la hermeticidad)
Usar puntas originales o puntas comprobadas (examinación de la hermeticidad) Acoplar la punta girándola Al trabajar con volumenes pequeños esperar 10 s después de acoplar la punta Tiempo de espera: 1 s

42 Faktor Z [µl/mg] 42

43 Que tan frecuentemente verificamos los instrumentos de medición?
Los instrumentos de medición deben ser verificados en intervalos de tiempo regulares. Nosotros recomendamos entre 3 y 12 meses para instrumentos de manejo de líquidos. Control de medios de análisis : La frecuencia depende según la ISO del tiempo de uso y de la intensidad de uso. La periodicidad debe de adaptarse a las exigencias individuales.

44 BPL Los aparatos deben de ser examinados, limpiados y calibrados periódicamente, siguiendo procedimientos normalizados de trabajo . La frecuencia para la calibración, revalidación y prueba, depende del instrumento en sí, de las recomendaciones de los fabricantes , de la experiencia del laboratorio y de la frecuencia de uso del aparato.

45 pero…. Cada certificado representa el RESULTADO de una calibración unicamente a un tiempo específico

46 Sabía Ud.? ¿La mayoria de las pipetas, independientemente del fabricante, fallan con el paso del tiempo? ~ 95 % de las fallas estan relacionadas al goteo del sistema de pipeteado, que conduce a la aspiración de volumenes menores! Ajustar la pipeta no resuelve el problema! Las fallas generalmente ocurren entre los intervalos de calibración.

47 Sabía Ud.? Fallas típicas de las pipetas de cojín de aire

48 Fugas no detectadas o dificiles de detectar:
Resultados cuestionables. Perdida de tiempo para identificar la causa del error durante la calibración y el rechazo de la pipeta al terminar la calibración. Selección de intervalos cortos de calibración para asegurar el buen funcionamiento de las pipetas Incremento de los costos, debido a los intervalos cortos de calibración.

49 Qué es la unidad PLT ? PLT significa Pipette Leak Testing unit.
La unidad PLT de BRAND es el aparato verificador de sellado de pipetas de cojín de aire, que detecta las fugas más pequeñas en pocos segundos. Después de generar un vacío, se mide el aumento de presión dentro de un período de tiempo. El cambio de presión en ese intervalo de tiempo, lleva a una taza de fuga, la tasa de fuga corresponde a un determinado volumen.

50 Unidad PLT La unidad PLT no reemplaza la prueba gravimetrica periódica, pero asegura los períodos entre las calibraciones, mediante el control diario de las pipetas. El aparato detecta incluso las fugas más pequeñas. De esta forma, la seguridad operativa de las pipetas mejora decisivamente.

51 ¿Con o sin puntas? ¿Verificación CON o SIN punta de pipeta?
Para verificar todo el sistema de pipeteado (completo), recomendamos realizar la prueba CON punta Y QUE ÉSTA SEA NUEVA . Cuando una fuga ha sido identificada, la prueba se vuelve a realizar SIN la punta para determinar en que parte está localizada la fuga (en la zona de acoplamiento de la punta o en la punta misma)

52 Unidad PLT tapón Adaptador monocanal Pantalla
Tecla de inicio/confirmación Botón de ajuste Tecla retroceder Indicador LED

53 Adaptadores Adaptador monocanal Para pipetas con punta
Adaptador monocanal para pipetas sin punta Adaptador multicanal para pipetas con y sin punta Filtro PE en adaptadores mono y multicanal (para proteger el aparato contra humedad o suciedad).

54 Resultados Los valores límite para la verificación , representan un límite de advertencia! Los límites de advertencia de todas las pipetas se almacenan. Si el límite de advertencia es alcanzado (La pantalla muestra FALLA y hay una luz roja parpadenate, el volumen faltante es detectable gravimetricamente. Este es el caso a partir de ¼ de tolerancia de volumen según la ISO Cuando la pipeta esta limpia, mecanicamente libre de error y pasa la prueba en la unidad PLT significa que el aparato esta dentro de las tolerancias de la norma ISO Límite

55 Resultados a) La barra ha sido completada en su totalidad hasta abajo: La pipeta es hermética b) La barra ha sido completada desde arriba, sólo hasta el sector de la marca de valor límite. Recomendamos realizar un ensayo gravimétrico. c) El llenado de la barra finaliza claramente por arriba de la marca de valor límite: La pipeta no es hermética. Debe hacerse un ensayo gravimétrico, y de ser necesario, la pipeta se debe enviar a reparación.

56 Bibliografia 1.- www.brand.de 2.- Catálogo Brand 800
3.-

57 Página web Brand

58 Descargas y soporte

59 Conclusiones 1.- La calidad de los resultados de análisis, a través de micropipetas de cojín de aire, dependen en gran medida de: El aparato o instrumento adecuado. Optimas condiciones del aparato o instrumento. Excelente manipulación. Excelente lectura del instrumento o aparato. De la disciplina, hábitos y cultura del usuario. 2.- Teniendo conocimiento de las alternativas de instrumentos así como las herramientas disponibles en el mercado, puedo realizar implementaciones y áreas de mejora en mi laboratorio.

60 Muchas gracias por Su atención!