Métodos para secuenciar el ARN

Presentación del tema: "Métodos para secuenciar el ARN"— Transcripción de la presentación:

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2 Métodos para secuenciar el ARN
Por métodos enzimáticos y químicos Directamente a partir del ARN Helicos Secuenciación del ARN A partir del ADNg Transcripción conceptual EST A partir del ADNc RNA-Seq Métodos para secuenciar el ARN

3 Science, 147 (1965): n = 77 Los primeros

4 Ribonucleasa T1 n = 120 Luego vino Fred Sanger

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6 Síntesis del ARN por la ARN polimerasa

7 Secuenciación del ARN a partir del ADNc
1.- Se extrae el ARN de la célula 2.- La transcriptasa inversa genera el ADNc 3.- Se somete el cDNA a una electroforesis y se seleccionan los fragmentos que tienen el tamaño adecuado para insertarlos en el vector de clonación. 4.- Se transforman bacterias con los vectores recombinantes y se genera una genoteca de ADNc 5.- A partir de un clon se purifica el plásmido y se secuencia el inserto por ambos extremos Secuenciación del ARN a partir del ADNc

8 Síntesis de ADNc a partir del ARNm
Los cDNA obtenidos a partir de RNAm, que se caracterizan por tener la cola poli(A), representan una instantánea de los genes que se están expresando en un momento dado y en unas condiciones determinadas, o sea, el transcriptoma. Síntesis de ADNc a partir del ARNm

9 Purificación del ARNm y síntesis del ADNc

10 Expressed sequence tags (EST)
Un EST es la secuencia parcial de un inserto clonado procedente de una genoteca de cDNA obtenida a partir del RNAm. Expressed sequence tags (EST)

11 Expressed sequence tags (EST)

12 Características de las genotecas de ADNc
1.- Se preparan a partir de varios organismos, tejidos, tipos celulares, condiciones patológicas o condiciones experimentales. 2.- La complejidad y la calidad de las genotecas varía mucho de una a otra. 3.- La mayoría son “nativas”, ya que la frecuencia de los clones refleja la abundancia de los distintos ARNm. 4.- Las genotecas “normalizadas” se han modificado para reducir la presencia de los mRNA más abundantes y aumentar la probabilidad de detectar los mRNA menos frecuentes. 5.- La mayoría se han generado con un cebador poli(T), de modo que los extremos 3’ están sobrerrepresentados. Características de las genotecas de ADNc

13 Características de los EST

14 Limitaciones de los EST

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16 RNA-Seq

17 Esquema general de la RNA-Seq

18 Generación de una biblioteca de ADNc
1.- Se extrae el ARN de las células. Se puede eliminar el ARNr y el ARNt o seleccionar únicamente el ARN con cola de poliA. 2.- La transcriptasa inversa sintetiza los ADNc (de doble hebra). Se fragmenta el ADNc y se seleccionan los fragmentos del tamaño apropiado. 3.- Se añaden adaptadores a los extremos de los ADNc para obtener una librería de fragmentos de ADNc. No es necesario clonarlos en un vector y transformar bacterias. 4.- La amplificación de los fragmentos de ADNc se lleva a cabo mediante variantes de la PCR (en emulsión o puenteada). Generación de una biblioteca de ADNc

19 Secuenciación masiva en paralelo (NGS)
5.- La secuenciación masiva en paralelo de los fragmentos de ADNc mediante las técnicas de nueva generación (Roche 454, Illumina Solexa o ABI SOLID) . 6.- Las lecturas obtenidas en el apartado anterior se ensamblan para generar el transcriptoma. Este proceso puede utilizar un genoma de referencia o hacerse totalmente de novo. Secuenciación masiva en paralelo (NGS)

20 Single-Molecule Sequencing (Helicos)

21 Evita los problemas asociados a la síntesis del ADNc

22 El artículo que describe el método

23 Terminador virtual

24 El secuenciador HeliScope y la celda de flujo
108 moléculas por cm2 El secuenciador HeliScope y la celda de flujo

25 Unión del ARN a la celda de flujo
El ARN poliadenilado (de forma natural o mediante la enzima poli(A)-polimerasa) y bloqueado en el extremo 3’ con un residuo de dA se une a la superficie de la celda de flujo, que está recubierta de poli(dT). Unión del ARN a la celda de flujo

26 Rellenado con T (fill) y adición de 3 TV (lock)
Fill: Se añade desoxitimidina natural y una ADN-polimerasa especial (con actividad transcriptasa inversa) para que todas las A de la cola de poliA estén emparejadas con una T. Así nos aseguramos de que la secuenciación comienza directamente en el ARN molde. Lock: Se añade polimerasa y 3 terminadores virtuales (TV): A, C y G. Los TV contienen un fluoróforo y están bloqueados en 3’ de forma reversible. Cada molécula de ARN incorpora el TV correspondiente. El proceso se detiene porque los TV tienen el extremo 3’ bloqueado. Rellenado con T (fill) y adición de 3 TV (lock)

27 Se toma una imagen y se elimina el fluoróforo
Se lavan los TV no unidos. Se excitan los fluoróforos y se toma una imagen. Cada señal fluorescente corresponde a un ARN distinto y nos indica la posición que ocupa en la celda de flujo. Se rompe el enlace que une el fluoróforo al TV y se desbloquea el extremo 3’ para un nuevo ciclo de incorporación de nucleótidos. Los fluoróforos liberados se eliminan con un lavado. Se toma una imagen y se elimina el fluoróforo

28 Escisión del fluoróforo y desbloqueo en 3’
En cada ciclo se añade un TV distinto, siempre en el mismo orden: C, T, A, G Lavado y nuevo ciclo Síntesis Escisión del fluoróforo y desbloqueo en 3’ Lavado + imagen En cada ciclo se añade un nucleótido distinto, siempre en el mismo orden

29 120 ciclos de reacción y toma de imágenes

30 La longitud media de las lecturas es de 33 nucleótidos

31 La plataforma Helicos también puede secuenciar el ADN

32 Helicos cierra por bancarrota

33 SeqLL utiliza su tecnología