Técnicas de Secuenciación de DNA

Presentación del tema: "Técnicas de Secuenciación de DNA"— Transcripción de la presentación:

1 Técnicas de Secuenciación de DNA
Dante Travisany F.

2 Tópicos Objetivos Avances Sanger: EST Next Generation Sequencing NGS:
Chain Terminator Shotgun Sequencing EST Next Generation Sequencing NGS: Sequencing By Synthesis Illumina – SBS. Roche 454 – Pyrosequencing SOLiD – Ligation Sequencing Semiconduction Sequencing – Ion Torrent.

3 Objetivo ATCGATCGATCGATCAGCTACGATCGATCGATCGATCGATCGATCAGCATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCATTTATATTCTGCCGTACGACCTGACTGATCTGATCGAGTCGATCGACTACATATCGATCGATCGACGATCGTACGTATGCATGCGATCGTATCGAGTCGTACTACGAGTCGACTGATCGTAGTATATATGCAGCGATCGATGATCGAGTCGATGTATTCTGACGCGATCTGAGTCTGATGCCGTAGCAACGCTATGCTACTAGCTGACGTCATGCGTACGTAGTCGTAGTACGTATCGATGCTGATGCAC

4 Objetivos Conocer: Las bases de la secuenciación de ADN
Principales tecnologías de Secuenciación Aplicaciones de la secuenciación de ADN

5 Actualmente

6 Presente / Futuro cercano
Costos: Dinero Computacionales Tiempo

7 Sanger 1977: F. Sanger y W. Gilbert - DNA Sequencing

8 dTTP dCTP dATP Extremo 3’ dGTP

9 ACTGXXXXXXXXXX TGAC X X G- X X X TGACXXG TGACXXXXXXXXG TGACXG

10 G ACT T C G T A 5’ 3’ TGACXXG TGACXXXXXXXXG TGACXG TGACA TGACXXXXXXXA
TGACXXXXXXC TGACXXXC TGACXXXXXT TGACXT TGACXXXXT G ACT T C G T A 5’ 3’

11 Sanger 1982: F. Sanger – Shotgun Sequencing
Nucleótidos - Primer Fago Secuenciado Se agrega un nuevo protocolo.

12 Shotgun Sequencing

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14 1987 - Primera Secuenciadora
ABI 370

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17 Phred Quality Values Phred : Software que realiza el basecalling.
Q = -10 log(Pe) Phred quality score Probability that the base is called wrong Accuracy of the base call 10 1 in 10 90% 20 1 in 100 99% 30 1 in 1,000 99.9% 40 1 in 10,000 99.99% 50 1 in 100,000 99.999%

18 Ejemplo Output Phred

19 ESTs Se capturan los mRNA mRNA -> cDNA Se ensamblan los transcritos
Transcriptoma

20 Next Generation Sequencing

21 Introducción a la SBS Secuenciación por Síntesis Enzimas: Tipo:
Ligasa Polimerasa Tipo: Single Molecule Basada en ensamble Ejecución: Tiempo Real Controlada Sincrónicamente

22 Secuenciación Por Síntesis
Solexa/Illumina: Polimerasa, Sincrónica, Basada en Ensamble

23 Illumina - SBS Se fragmenta el DNA Se reparan los extremos
Se agregan los adaptadores

24 Illumina - SBS Se agrega el DNA a la placa
Se hibrida aleatoriamente con los adaptadores que estan en la placa

25 Illumina - SBS Se agregan NTPs sin marcar y DNA polimerasa.
Comienza la amplificación

26 Illumina - SBS Se denatura el DNA y se vuelve a realizar la amplificación puente. Se han generado millones de Clústers en la placa.

27 Illumina - SBS Se agregan los dNTPs, cada uno posee un fluoroforo de color particular: G - Amarillo. C – Azul A – Rojo T - Verde Se excita con un laser y se captura una imagen.

28 Illumina - SBS Se excita con un laser y se captura una imagen.
La imagen capturada en una posición específica corresponde al primer nucleótido.

29 Illumina - SBS

30 Illumina - SBS Los ciclos de secuenciación se repiten hasta determinar la secuencia del templado. Una base a la vez.

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32 Secuenciación Por Síntesis
Roche Pirosecuenciación: Polimerasa, Sincrónica, Basada en ensamble.

33 Roche 454- Pirosecuenciación - SBS
El DNA es Nebulizado Se fragmenta en tamaños aleatorios

34 Roche 454- Pirosecuenciación - SBS
Se agregan adaptadores universales (Adaptador A’ y B’) a los Extremos Se denatura

35 Roche 454- Pirosecuenciación - SBS
Cada Perla ‘bead’ contiene miles de adaptadores, pero solo se le adhiere un fragmento de DNA que queda atrapado en una emulsión que contiene en su interior los elementos para una PCR.

36 Roche 454- Pirosecuenciación - SBS
El DNA se amplifica en esta emulsión Generando cientos de copias en cada perla

37 Roche 454- Pirosecuenciación - SBS
Estas son puestas en la PicoTiter Plate (PTP). El diseño de esta permite una bead por orificio.

38 Roche 454- Pirosecuenciación - SBS

39 454 summary Run time: 8 Hrs Produce 100's Mb of seq
Read length: 300bp – 400bp 2011 → 740bp!!! Applications and Challenges De novo sequencing Metagenomics Gene expression Variation detection Homopolymers problem

40 Secuenciación Por Síntesis
ABI - Secuenciación por Ligación: Ligasa, Sincrónica, Basada en ensamble.

41 Sequenciación por Ligación - SBS

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43 Secuenciación por Semiconducción
Ion Torrent

44 Secuenciación por Semiconducción
Al incorporarse un núcleotido a la hebra de ADN, la polimerasa libera un ion Hidrógeno.

45 Secuenciación por Semiconducción
Matriz de alta densidad de pozos que permiten generar este proceso paralelamente Cada pozo secuencia una hebra.

46 Secuenciación por Semiconducción

47 Secuenciación por Semiconducción

48 Secuenciación por Semiconducción

49 Comparación Métodos

50 454 Vibrio parahaemolyticus
Phred Qual

51 Ion Torrent - Vibrio parahaemolyticus
Phred Qual

52 Aplicaciones – Tecnologías de Secuenciación
De novo Genome Assembly Secuenciación completa del genoma de un organismo, sin referencia previa.

53 Aplicaciones – Tecnologías de Secuenciación
De novo Genome Assembly (454 o Illumina) Secuenciación completa del genoma de un organismo, sin referencia previa. Tamaño del Genoma Coverage esperado Coverage real Complejidad del Genoma Capacidad de Cómputo

54 Panda Genome 2.25 Gigabases -> de núcleotidos cubrieron el 94% del genoma. Sólo se utilizo Illumina. Se utilizaron especies de referencia para formar los cromosomas.

55 Aplicaciones – Tecnologías de Secuenciación

56 Aplicaciones – Tecnologías de Secuenciación
Metagenómica (454) Estudio de los metagenomas, secuenciación del material genetico obtenido desde el ambiente / organismo. Clasificación Taxonómica Perfil Metabólico

57 Aplicaciones – Tecnologías de Secuenciación
Metagenómica

58 Aplicaciones Tecnologías de Secuenciación
Genome Mapping (Illumina / SOLiD) Secuenciación con referencia, permite identificar variantes inter/intra especies. Variaciones estructurales, cambios en los genomas. SNPs Variantes estructurales

59 Aplicaciones Tecnologías de Secuenciación
RNA –Seq Mapping (Illumina / SOLiD) Identificar expresión diferencial, secuenciación del transcriptoma en diferentes condiciones Expresión Diferencial SNPs Isoformas

60 Aplicaciones Tecnologías de Secuenciación
RNA –Seq De novo (Illumina) Identificar expresión diferencial, secuenciación del transcriptoma en diferentes condiciones, reconstrucción del transcriptoma en un organismo, condición específico Obtención transcriptoma Expresión Diferencial SNPs

61 Gracias

62 Illumina –Fluorescent Reverse Terminator