Biol 3030 – Lab Desarrollo JA Cardé. Objetivos -Biotecnología -Subcloning -Vectores -3 Modulos 1)Ligación : fragmento + vector 2)Transformacion de E.

Presentación del tema: "Biol 3030 – Lab Desarrollo JA Cardé. Objetivos -Biotecnología -Subcloning -Vectores -3 Modulos 1)Ligación : fragmento + vector 2)Transformacion de E."— Transcripción de la presentación:

1 Biol 3030 – Lab Desarrollo JA Cardé

2 Objetivos

3 -Biotecnología -Subcloning -Vectores -3 Modulos 1)Ligación : fragmento + vector 2)Transformacion de E coli 3)Selección por resistencia, crecimiento y ensayo de transfomantes 4)Opcional ; Extraccion de DNA Plasmido El Vector: pUC8, 2700pb Sitio para Eco R1 en M13 mp en el fragmento de LacZ

4 pUC8 – 2665 bp Contiene parte del gen lac Z Codifica para ß galactosidasa Metabolismo de galactosidos Operon de lactosa α fragment del gene de lacZ

5 -E coli mutada en lac Z -Su cromosoma tiene el fragmento Ω de lac Z -Cuando α y Ω interactuen lac Z sera funcional -α complementation -Operon de lac -Represores (lac) -Activadores (CAP+ cAMP) -Inductores (IPTG) atrapan al represor -Sustratos para ß galactosidasa -Lactosa -X-Gal, hidrolizado se pone azul -PLT transformantes con pUC donde lacZ sea funcional seran azules! -ONPG – sustrato para ßgal pero amarillo  espectrofoto

6 MCR/MCS MCS insertado dentro del lac Z gene pero no interfiere Insertos caeran en el MCS y si interrumpen el lac Z gene PLT transformantes con el inserto seran color no azul… blancas

7 Ligacion: Vector linearizado T4 DNA ligasa Fragmentos de DNA Mg+2 Enlace fosfodiester 5’-3’ 37 C vs 4-22 C

8 Recircularizacion Concatamerizacion Alk Phosph Orientacion de la ligacion Transformacion Celulas competentes (JM109) -No resistencia -No plasmids -No enzimas de restriccion

9 Eficiencia de la transformacion -supercoiled > circular > lineal 10 ngs es suficiente 100 ngs inhibe 1/10000 celulas se transforma Se define 3 de transformantes por µg de DNA 10 ng para 1ml de celulas Salen 100 colonias = 1000 transformantes/ml 1000transf/0.01ug = 1x10^5 Screening Blue/White -Resistencia ayuda a seleccionar (Amp) -Pero de las que crecen cuantas tienen el gen? -Azules vs Blancas - Azules lacZ+ ONPG amarillo -Blancas lacZ- ONPG no

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19 Study Questions

20 Resultados Recuerde discutir los resultados objetivo por objetivo. Cada objetivo tiene una pregunta de investigación, una hipótesis, alguna tabla o figura que los resume y su discusión y conclusión. Al final una conclusión general de todo el ejercicio.