STUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE HUMORAL EN PACIENTES CON ANEMIA DREPANOCÍTICA INSTITUTO DE HEMATOLOGÍA E INMUNOLOGÍA ESTUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE HUMORAL.

Presentación del tema: "STUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE HUMORAL EN PACIENTES CON ANEMIA DREPANOCÍTICA INSTITUTO DE HEMATOLOGÍA E INMUNOLOGÍA ESTUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE HUMORAL."— Transcripción de la presentación:

1 STUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE HUMORAL EN PACIENTES CON ANEMIA DREPANOCÍTICA INSTITUTO DE HEMATOLOGÍA E INMUNOLOGÍA ESTUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE HUMORAL EN PACIENTES CON ANEMIA DREPANOCÍTICA

2 INTRODUCCIÓN Los trastornos de la hemoglobina (Hb) constituyen el grupo de enfermedades monogénicas más frecuentes en el mundo ocupando la anemia drepanocítica (AD) un lugar cimero entre las mismas. Hb S es el nombre de la molécula de Hb anormal, siendo este defecto molecular el primero en ser demostrado en humanos. La secuenciación nucleotídica del mARN de los genes de la globina  s ha revelado que el codón normal GAG en la posición  6 ha sido reemplazado por GUG. Este cambio determina la inserción de valina en la posición del ácido glutámico que se encuentra en la Hb A, predominante en el adulto normal, lo que favorece la polimerización de las moléculas de Hb S en condiciones de baja presión parcial de oxígeno. La gelificación distorsiona el glóbulo rojo y disminuye su flexibilidad lo que puede provocar fenómenos oclusivos vasculares.

3 INTRODUCCIÓN (Continuación) Los pacientes con AD tienen una gran variabilidad en el cuadro clínico. Los individuos heterocigotos (Hb AS) son comúnmente asintomáticos, en cambio, los homocigotos (Hb SS) presentan diferentes manifestaciones clínicas las cuales no se expresan en el momento del nacimiento debido a los niveles elevados de hemoglobina fetal (Hb F) que interfiere en la polimerización de la Hb S. Las manifestaciones clínicas más frecuentes en los primeros años de vida son: - anemia - ictericia - crisis mano - pie - crisis vasooclusivas dolorosas abdominales y ostiomioarticulares. - infecciones

4 INTRODUCCIÓN (Continuación) Trastornos del sistema inmune: - Los neutrófilos presentan alteraciones en la quimiotaxis, baja actividad oxidativa, escaso poder bactericida y mayor adhesividad al endotelio. - La fibrosis esplénica, presente en la mayoría de estos enfermos, compromete la síntesis de anticuerpos y la función fagocítica. - Una actividad opsónica disminuida, así como trastornos en la actividad de la vía alternativa del complemento. - Elevación de citocinas inflamatorias: IL 6, IL 1, TNF , formas solubles de las moléculas de adhesión ICAM-1, VCAM-1, E-Selectina y P-Selectina. - Un aumento de reactantes de fase aguda, como la proteína C reactiva y el amiloide A sérico, aún en enfermos en estado basal, lo que indica un nivel de inflamación constante subclínico.

5 INTRODUCCIÓN (Continuación) - Se ha referido tanto una disminución en los niveles relativos de linfocitos T por deficiencias en células CD4 , como aumentos de células T citotóxicas. - Hipergammaglobulinemia, ya sea a expensas de IgM o más frecuentemente de la clase IgG siendo las subclases predominantes la IgG1 e IgG3. - Se ha demostrado la síntesis de autoanticuerpos contra antígenos de grupos sanguíneos y contra los fosfolípidos de la membrana celular de los hematíes falciformes, entre los que se destacan anticuerpos antifosfatidiletanolamina y antifosfatidilserina. Considerando que la severidad clínica de la AD al parecer está influenciada por múltiples factores, se plantea la siguiente hipótesis de trabajo:

6 HIPÓTESIS DE TRABAJO Alteraciones de la respuesta inmune humoral pueden incidir en la expresión clínica y severidad de la enfermedad en pacientes con AD.” “ Alteraciones de la respuesta inmune humoral pueden incidir en la expresión clínica y severidad de la enfermedad en pacientes con AD.” OBJETIVO GENERAL Evaluar las posibles alteraciones de diversos parámetros de la respuesta inmune humoral en enfermos con AD en diferentes fases clínicas. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1- Determinar la actividad de las vías clásica y alternativa del sistema complemento, así como la concentración de algunos de sus componentes en diferentes fases clínicas. 2- Determinar los niveles de inmunocomplejos circulantes en diferentes fases clínicas. 3- Evaluar los fenómenos de solubilización y de inhibición de la formación y precipitación de inmunocomplejos en diferentes fases clínicas.

7 OBJETIVOS ESPECÍFICOS (Continuación) 4- Realizar estudios seriados del complemento e inmunocomplejos circulantes y de la proteína C reactiva. 5- Evaluar la actividad funcional del factor D de la vía alternativa del complemento en enfermos en estado basal. 6- Determinar la actividad del sistema complemento en enfermos en estado basal con y sin historia previa de complicaciones clínicas. 7- Determinar los niveles de subclases de IgG en enfermos en estado basal, con y sin historia previa de complicaciones clínicas. 8- Identificar la posible presencia de anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA) en enfermos en estado basal y con crisis vasooclusiva dolorosa.

8 UNIVERSO DE LA MUESTRA Se incluyeron enfermos con el diagnóstico de AD atendidos en la consulta de Hemoglobinopatías del Instituto de Hematología e Inmunología: - con 15 o más años de edad, - en estado basal, sin manifestaciones clínicas en los 3 meses previos al estudio, - con crisis vasooclusivas dolorosas de cualquier focalización, sin síntomas ni signos de infección u otras complicaciones clínicas, - con úlceras maleolares sin otras complicaciones de la enfermedad, las infecciones demostradas estaban limitadas a la zona de la úlcera, - con crisis hepática cuyo diagnóstico se realizó por el cuadro clínico y pruebas funcionales hepáticas.

9 UNIVERSO DE LA MUESTRA (Continuación) Ninguno de los enfermos recibió transfusiones de glóbulos rojos en los 3 meses anteriores al estudio y en todos el HBsAg fue negativo. Los valores normales en cada uno de los estudios realizados se obtuvieron en 30 individuos sanos con características de edad, sexo y raza similares a los de la muestra problema. BIOÉTICA A todos los pacientes se les explicó de forma comprensible la naturaleza de su enfermedad, los riesgos y beneficios de los procedimientos a emplear, la confidencialidad de los resultados, precisando el principio de voluntariedad. A continuación se solicitó, mediante firma de documento, su consentimiento de participación en la investigación. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Se empleó el análisis de varianza no paramétrico de Kruskal - Wallis, el coeficiente de correlación de rangos de Spearman y la t de Student. Se consideró un nivel de confianza del 95%.

10 ESTUDIOS REALIZADOS  Activación del sistema complemento en diferentes fases clínicas. Se estudiaron 45 enfermos, se agruparon: 23 en estado basal, 14 con crisis vasooclusivas dolorosas y 8 con crisis hepática. En todos los casos se midió la actividad hemolítica de la vía clásica del complemento (AHVC), la vía alternativa (AHVA), C3 y C4.  Determinación de inmunocomplejos circulantes en diferentes fases clínicas. Se estudiaron 100 enfermos, agrupados: en estado basal, 42; con crisis vasooclusivas dolorosas, 28; con úlceras maleolares, 14 y con crisis hepática, 16. Los inmunocomplejos circulantes se determinaron mediante actividad anticomplementaria, precipitación con PEG 6000, inhibición de roseta EAC, título de inmunoconglutininas.

11 ESTUDIOS REALIZADOS (Continuación)  Estudio de la solubilización e inhibición de la formación y precipitación de inmunocomplejos. El estudio se realizó en 13 enfermos en crisis hepática y 26 en condiciones basales. La inhibición de la precipitación de inmunocomplejos se determinó haciendo reaccionar el 125 I - TT con una cantidad equivalente de anti TT en presencia de suero problema. La solubilización de inmunocomplejos se determinó añadiendo un complejo insoluble de 125 I - TT / anti TT al suero problema.  Estudio seriado del complemento e inmunocomplejos circulantes. Se efectuó la medición seriada en 13 enfermos que cursaron cada uno por diferentes fases clínicas. De las 35 muestras de suero analizadas, 17 correspondieron a condiciones basales, 8 a crisis vasooclusivas dolorosas y 10 a crisis hepáticas. En todas las muestras se midió AHVC, AHVA, factor B, C3, C4 e inmunocomplejos circulantes mediante la prueba de desviación del C1q (PDC1q) y PEG 6000.

12 ESTUDIOS REALIZADOS (Continuación)  Estudio seriado de la proteína C reactiva. Se analizaron 42 muestras de sangre, obtenidas en diferentes momentos, de 16 enfermos en condiciones basales. La proteína C reactiva se detectó mediante un método de aglutinación con latex.  Evaluación de la actividad funcional del factor D del sistema complemento. Se estudiaron 28 enfermos en estado basal. Se midió la AHVA, factor B y factor D.

13 ESTUDIOS REALIZADOS (Continuación)  Comparación de los niveles de complemento entre grupos de enfermos con AD en estado basal, con y sin historia de complicaciones clínicas previas al estudio. Se estudiaron 46 enfermos en estado basal. Se revisaron las historias clínicas y se analizó la enfermedad en el año previo al estudio, se clasificaron en dos grupos: con y sin manifestaciones clínicas. Se determinó en ambos grupos la AHVC, AHVA, factor B, C3 y C4.  Comparación de los niveles de subclases de IgG entre grupos de enfermos con AD en estado basal, con y sin historia de complicaciones clínicas previas al estudio. Se estudiaron 46 enfermos en estado basal. Se revisaron las historias clínicas y se analizó la enfermedad en el año previo al estudio, se clasificaron en dos grupos: con y sin manifestaciones clínicas. Se determinaron los niveles de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

14 ESTUDIOS REALIZADOS (Continuación)  Determinación de ANCA en enfermos en diferentes fases clínicas. Se estudiaron 55 enfermos, 35 con crisis vasooclusiva dolorosa y 20 en estado basal. Los niveles de cANCA y pANCA fueron determinados mediante juegos comerciales anti MPO Elisa y anti PR3 Elisa. Se incluyeron como controles, además de los 30 sujetos sanos, 50 enfermos con glomerulonefritis, 45 con nefroangioesclerosis y 25 con diversas formas de vasculitis no precisadas.

15 RESULTADOS

16 Determinación Controles Normales ( n = 30 ) Estado Basal ( n = 23 ) Crisis Vasooclusiva dolorosa ( n = 14 ) Crisis Hepática ( n = 8 ) AHVC (CH50) 27.5  6.525.4  5.426.2  4.625.3  4.7 AHVA ( %) 98.3  15.7 73.7  19.5 (  ) 81.7  17.0 (   ) 76.9  18.9 (   ) C3 ( g / L) 1.5  0.381.14  0.30 (    ) 1.34  0.38 (  ) 1.16 ± 0.39 (    ) C4 ( g / L ) 0.35  0.15 0.37 ± 0.07 0.30  0.11 0.29 ± 0.08 Leyenda - (  ) p < 0.05; (   ) p < 0.005; (    ) p < 0.001 Tabla 1. Niveles de complemento en enfermos con anemia drepanocítica en diferentes fases clínicas.

17 Determinación Estado Basal ( n = 42 ) Crisis Vasooclusiva dolorosa ( n = 28 ) Úlceras Maleolares ( n = 14 ) Crisis Hepática ( n = 16 ) Control Normal ( n = 30 ) Inhibición Roseta EAC (% inhibición) 16.2 ± 9.7 15.8  12.121.7  13.0 (  ) 30.2  10.2 (   ) 12.5  12.5 Actividad Anti complementaria (Uds. CH50 residuales) 1.34  0.21.26  0.2 1.19 ± 0.21 1.05 .22 (   ) 1.35  0.30 Precipitación PEG 6000 (DO. 10 -2 ) 13.0  7.114.5  5.921.0  12.2 (  ) 28.6  11.6 (   ) 13.0  9.0 IKs (Recíproco de la dilución) M = 32 (16 - 256) M = 32 (16 - 258) M = 64 (16 - 256) (  ) M = 64 (16- 256) (  ) M = 32 (0 - 64) AHVC (CH50) 26.3  3.727.1  3.5 26.8 ± 4.0 25.0  4.827.5  6.5 C4 ( g / L ) 26.8  4.326.8  4.025.2  6.1925.0  7.527.5  7.5 C3 d (  g / dl) 12.8  2.112.6  2.016.2  3.6 (  ) 16.0  3.2 (  ) 12.0  3.0 Tabla 2 – Inmunocomplejos circulantes y niveles de complemento en enfermos con anemia drepanocítica en diferentes fases clínicas. Leyenda - Iks: inmunoconglutininas; M: mediana (  ) p< 0.05; (   ) p< 0.001

18 Determinación PACIENTES CONTROLES ( n = 13 ) ( n = 30) p AHVC (CH 50 ) 23.2  1.8727.5  6.5 NS AHVA (%) 81.8  6.898.0  16.0 < 0.01 PDC1q (% de inhibición) 19.5  8.610.0  10.0 < 0.01 C3 (g / L) 1.07  0.151.52  0.50 < 0.01 C4 (g / L) 0.28  0.040.35  0.05 NS AHFB (%) 77.75  7.82100.0  24.0 < 0.01 IPIC (%) 24.2  19.5391.41  8.45 < 0.01 SIC (%) 10.4  7.2947.11  9.48 < 0.01 Tabla 3. Solubilización e inhibición de la formación y precipitación de inmunocomplejos, así como niveles de complemento e inmunocomplejos circulantes en enfermos con anemia drepanocítica con crisis hepática. Leyenda – IPIC: inhibición de la formación y precipitación de inmunocomplejos SIC: solubilización de inmunocomplejos

19 Estudio seriado de la proteína C reactiva Se demostró la proteína C reactiva positiva en 23 muestras de sangre, extraidas en diferentes momentos, de 12 de los 16 enfermos en estado basal estudiados.

20 Tabla 4 – Evaluación de la actividad funcional del factor D de la vía alternativa en pacientes con anemia drepanocítica en estado basal. Determinación Pacientes ( n = 28 ) Control Normal ( n =30) p AHVA ( % ) 80.1  6.098.0  16.0  0.001 AHFB ( % ) 81.6  7.3100.0  24.0  0.001 AHFD ( % ) 93.0  12.595.0  14.0 NS

21 Tabla 5- Comparación de los niveles de complemento entre los grupos de enfermos con anemia drepanocítica en estado basal con y sin complicaciones clínicas previas y con los controles normales. Enfermos Controles Determinación Con complicaciones Sin complicaciones normales (n = 25) (n = 21) (n = 30) AHVC (CH50) 25.8 ± 3.0 26.4 ± 2.8 27.0 ± 2.7 AHVA (%) 78.1 ± 10.2 (  ) 97.1 ± 14.8 98.0 ± 16.0 AHFB (%) 75.0 ± 11.3 (  ) 98.6 ± 17.4 100.0 ± 24.0 C3 (g / l ) 0.90 ± 0.37 (  ) 1.53 ± 0.44 1.52 ± 0.50 C4 (g / l ) 0.32 ± 0.10 0.33 ± 0.11 0.35 ± 0.15 Leyenda – (  ) diferencia significativa con respecto al grupo de pacientes sin complicaciones y controles normales para una p  0.001.

22 Tabla 6- Comparación de los niveles de las subclases de IgG entre los grupos de enfermos con anemia drepanocítica en estado basal con y sin complicaciones clínicas previas y con los controles normales. Enfermos Controles Determinación Con complicaciones Sin complicaciones normales (n = 25) (n = 21) (n = 20) IgG1 11.56  1.32 (  ) 8.98  1.12 8.32  1.25 IgG2 6.18  0.73 (  ) 4.59  0.96 4.78  0.93 IgG3 0.56  0.17 0.55  0.15 0.49  0.10 IgG4 1.05  0.27 0.95  0.17 0.99  0.14 Leyenda - (  ) diferencia significativa con respecto a los controles normales y al grupo de pacientes sin complicaciones para una p< 0.001.

23 Tabla 7 – Anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA) en enfermos con anemia drepanocítica. Pruebas ( U / ml ) Estado Basal ( n  20 ) Crisis Vasooclusiva dolorosa ( n  35 ) Glomerulo- nefritis ( n  50 ) Nefroangio- esclerosis ( n  45 ) Vasculitis no precisadas ( n  25 ) Control Normal ( n  30 ) Anti MPO 171.0  32.5239  33.2 (  ) 168.3  25.1165.9  27.2170.2  5.8166  26.7 Anti PR3 136.5  23.0142.5  9.2134.5  21.1138.2  22.7135.8  23.5133.5  18.0 Leyenda - MPO: mieloperoxidasa; PR3: proteinasa 3 (  ): p  0.001

24 ESTÍMULO A LA MÉDULA ÓSEA (ESTRÉS DE LA ANEMIA) LIBERACIÓN DE RETICULOCITOS DE ESTRÉS ADHESIÓN AL ENDOTELIO ERITROCITOS FALCIFORMES IRREVERSIBLES ESTRÉS TISULAR (FENÓMENOS INFLAMATORIOS) LIBERACIÓN DE CITOCINAS: IL-1, IL- 6, FNT PROTEINA C REACTIVA LIBERACIÓN DE ANTIGENOS TISULARES (ACTIVACIÓN DE Th1) FORMACIÓN DE ANTICUERPOS IgG ACTIVACIÓN DEL SISTEMA DE ESTRÉS HIPOTÁLAMO - HIPÓFISO - ADRENAL ACCIÓN SUPRESORA SOBRE Th1 DESVIACIÓN Th1  Th2 ACTIVACIÓN DE LA INMUNIDAD HUMORAL: AUTOANTICUERPOS; INMUNOCOMPLEJOS; HIPOCOMPLEMENTEMIA ;  IPIC;  SIC AMPLIFICACIÓN DEL DAÑO Y DEL ESTRÉS TISULAR PROTEINAS DE CHOQUE TÉRMICO RESPUESTA AUTOINMUNE PREVIENE REACCiONES AUTOINMUNES ESTIMULA CÉLULAS NK MODULA ACTIVACIÓN PLAQUETARIA OCLUSIÓN LIBERACIÓN DE GLUCOCORTICOIDES IL-6 Figura 1: Esquema integrador de las alteraciones de la respuesta inmune que se observan en pacientes con anemia drepanocítica. Nota: IPIC - Inhibición de la precipitación de inmunocomplejos; SIC - Solubilización de inmunocomplejos; línea discontinua- - -Inhibición. eosinofilia mastocitosis  I gE