Principle of PCR Prof. Dr. Baron 1 Principio de PCR.

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1 Principle of PCR Prof. Dr. Baron 1 Principio de PCR

2 Principle of PCR Prof. Dr. Baron 2 PCR - Reacción en cadena de la polimerasa 3‘ 5‘ 3‘ 5‘ 3‘ 5‘ 3‘ 5‘ 3‘

3 Principle of PCR Prof. Dr. Baron 3 Progresión de PCR

4 Principle of PCR Prof. Dr. Baron 4 Cebadores para PCR Los cebadores están al comienzo de la molecula para la polimerasa de ADN y están compuestos de un único ADN entrelazado (ssDNA) Los cebadores tienen 20-40 nucleótidos de longitud Los cebadores han de ser sintetizados (Muchas compañias viven de eso) Un cebador es complementario de una cadena de ADN para ser amplificado (Molde de ADN) Un software de cebador disponible en internet facilita la determinación del cebador Son necesarios dos cebadores, Cebador directo and Cebador inverso Recocido de cebadores antiparalelos del extremo 3‘ del molde de ADN Ambos cebadores deberían tener la misma tempreatura de recocido (Ta) Ta depende de la longitud y contenido de carga genética El cebador más fuerte se une al molde de ADN con la más alta Ta Cuanto mayor es la Ta más específica es la unión del cebador al molde de ADN. Los rangos de la Ta son desde 52°C a 65°C

5 Principle of PCR Prof. Dr. Baron 5 PCR de 20 Ciclos

6 Principle of PCR Prof. Dr. Baron 6 PCR de 20 ciclos

7 Principle of PCR Prof. Dr. Baron 7 Amplificación por PCR de ADN Amplificación de 20 a 50 ciclos -20 ciclos  2 20 copias de ADN = 10 6 -fold amplificación -30 ciclos  2 30 copias de ADN = 10 9 -fold amplificación -40 ciclos  2 40 copias de ADN = 10 12 -fold amplificación Fórmula: 2 n ADN copias, n = número de ciclos de PCR Elaborado por K. Mullis en 1985, premio nobel en 1993, uso del ADN polimerasa de E. coli, Sin automatización posible La automatización fue posible después de introducir ADN polimeresa a calor estable (e.g. Taq-Polimerasa) La automatización de la PCR por termociclador programable El 1.er ciclo obtiene ADN de longitud indefinida, dos longitudes definidas de copias de ADN después del 3.er ciclo.

8 Principle of PCR Prof. Dr. Baron 8 Taq-Polimerasa Origen/organismoThermus aquaticus Habitatgeyser, Yellowstone NP ('76) Peso molecular94 kDa (rec. from E. coli) pH óptimo7 – 8 Temperatura óptima in vitro70 - 80°C Índice de síntesis150 nucleotidos/s @ 75-80°C 22 nucleotidos/s @ 55°C 1.5 nucleotidos/s @ 37°C 0.25 nucleotidos/s @ 22°C Índice de Error in vitro1 in 5000 nucleotides Estabilidad/Vida media biológica12 min @ 94°C 6 min @ 97°C Actividad adicional enzimática5´ 3´ exonuclease Limitación del número de ciclos de PCR Vida media biológica de Taq polimerasa @ 95°C Escasez de cebadores y dNTP's La dsDNA amplicada une los cebadores

9 Principle of PCR Prof. Dr. Baron 9 Fin