Equipo 6..  Conocer el fundamento para transformar células bacterianas.  Realizar la técnica de transformación bacteriana.  Aprender a identificar.

Presentación del tema: "Equipo 6..  Conocer el fundamento para transformar células bacterianas.  Realizar la técnica de transformación bacteriana.  Aprender a identificar."— Transcripción de la presentación:

1 Equipo 6.

2  Conocer el fundamento para transformar células bacterianas.  Realizar la técnica de transformación bacteriana.  Aprender a identificar células transformantes mediante su fenotipo.  Conocer la definición de organismo transgénico.  Conocer las aplicaciones de la transformación bacteriana: beneficios y riesgos.

3  Herramienta que permite técnicas de manipulación y selección de material genético.

4 Es aquél que ha sufrido la alteración de su material hereditario (genoma) por la introducción artificial (manipulación genética) de un gene exógeno, esto es, proveniente de otro organismo completamente diferente.

5  Es un sistema que permite introducir en una célula hospedera un fragmento de DNA que se pretende clonar.  En esta célula hospedera el vector se replica y se expresa.

6 1.- Debe de tener su propio origen de replicación. 2.- Debe tener un sitio de clonación múltiple (SCM). 3.- Debe poseer marcadores genéticos.

7  Molécula que resulta de la unión de un DNA vector con el DNA de interés.  Se coloca en el sitio múltiple de clonación Vector recombinante pET-TEM-1-ompA  -lactamasa. Gen de interés

8 Para la introducción del DNA existen diferentes técnicas:  Choque Térmico  Microelectroporación

9  Las bacterias hospederas son pre-tratadas con agentes que aumentan su permeabilidad membranal, como es el aumento de la temperatura  Los iones como el Ca 2+, disminuyen la repulsión de cargas eléctricas entre los nucleótidos y la membrana, facilitando la entrada del plásmido al interior de la célula.

10  Células competentes: Células que han recibido un tratamiento apropiado para llevar a cabo la introducción del material genético.  Células transformantes: Células que contiene el material genético foráneo, a las cuales se les restauro su permeabilidad de la membrana y se encuentran en condiciones óptimas de crecimiento.

11  Células competentes: E. coli DH5   Vector recombinante: Plásmido pET-TEM-1- ompAβ-lactamasa.  Medio para restaurar crecimiento de células transformantes: SOC. Medio Luria con 20mM Glucosa.  Medio de selección: Cajas Petri con medio LB/Kanamicina (30 µg/mL).

12  Transformación de células competentes con el vector PET-TEM-1 por el método de choque térmico. 1. Tomar un tubo de células competentes del congelador y colocarlas en hielo 2. Añadir 1 a 5 µL del plásmido a un microtubo que contiene 100 µL de células de E. coli competentes. 3. Mezclar. 4. Dejar en hielo por 30 minutos. 5. Dar choque térmico a 42ºC durante 45 segundos (NO AGITAR).

13 6. Agregar 450 µL de medio SOC e incubar por 60 minutos a 37ºC con agitación 225 a 250rpm. 7. Concentrar las células por centrifugación. 8. Eliminar el sobrenadante y resuspender el paquete celular en 100 µL de medio SOC. 9. Esparcir los 100 µL de bacterias transformadas, en las cajas con medio de selección (Agar -LB- Kanamicina). 10. Incubar a 37ºC por 24 h. Observar crecimiento y guardar la caja a 4ºC.

14 11. Como control negativo incubar 100 µL de células competentes en medio de selección a 37ºC por 24 h. 12. Calcular la eficiencia de la transformación.