MODELOS ANIMALES DE ENFERMEDAD EN INVESTIGACIÓN TRANSLACIONAL Virginia Hernández Gea Laboratori de Recerca Translacional d’Oncologia Hepàtica BCLC group.

Presentación del tema: "MODELOS ANIMALES DE ENFERMEDAD EN INVESTIGACIÓN TRANSLACIONAL Virginia Hernández Gea Laboratori de Recerca Translacional d’Oncologia Hepàtica BCLC group."— Transcripción de la presentación:

1 MODELOS ANIMALES DE ENFERMEDAD EN INVESTIGACIÓN TRANSLACIONAL Virginia Hernández Gea Laboratori de Recerca Translacional d’Oncologia Hepàtica BCLC group. IDIBAPS. Hospital Clínic

2 MODELOS ANIMALES Desarrollo de tratamiento de muchas enfermedades humanas Desarrollo tratamientos (tratamiento de DM con insulina en perros) Validación mecanismos de acción (tratamiento de asma con anti- IL5 en roedores y primates ) Estudios de seguridad /Eficacia (toxicidad de penicilina Ginea pigs) Avances en investigación del genoma y biología molecular

3 ELEGIR EL MODELO ADECUADO No hay modelos disponibles para todas las enfermedades Determinadas condiciones etiología-especifica no son patogénicas en animales Virus de la Hepatits C virus no afecta roedores La respuesta a un determinado agente inductor puede cambiar entre animales y humanos

4 CARACTERÍSTICAS DEL MODELO ANIMAL IDEAL Reproducibilidad % animales que alcanzan el estadio de interés Especificidad alteración deseada sin otras complicaciones Coste directo e indirecto mantenimiento colonia Seguridad riesgo para el personal Tamaño volumen de sangre requerido, accesos vasculares, cantidad fármaco Ética aceptabilidad del modelo Viabilidad del modelo experiencia en el laboratorio, mano de obra SIMILITUD CON LA ENFERMEDAD HUMANA OTRAS CONSIDERACIONES Patogénesis y fenotipo similar a la enfermedad en humanos Reflejo de interacciones celulares y moleculares (microambiente) Similares biomarcadores de enfermedad Predicción fiable de toxicidad y respuesta a terapias aprobadas en humanos

5 DESARROLLO HEPÁTICO Chu & Sadler. Hepatology 2009 La formación del hígado empieza 60-72 horas post-fertilización El hígado esta completamente desarrollado a los 5 días El desarrollo hepático es independiente de la vasculogenesis Ventajas Camadas de gran número Creación de transgénicos es fácil, rápida y barata Manipulación genética unida a fluorescencia permite visualización en tiempo real de todo el proceso de desarrollo

6 HEPATITIS AGUDA POR VHC No modelos en animales pequeños que reproduzca todo el ciclo infección La inoculación virus en roedores (incluso inmunodeprimidos) no produce infección detectable Chimpancé Permite el estudio de todos los pasos del ciclo vital de la infección Replicación/Infección/Producción virus Modelo immunocompetente Estudio de la respuesta inmune huésped (innata & adaptativa) Permite analizar cambios precoces en la expresión génica Obtención muestras tras infección aguda Probar de forma directa agentes antivirales Único modelo para el estudio y desarrollo de vacunas Limitaciones Éticas Escasa disponibilidad Coste prohibitivo Bukh J. Gastroenteroogy 2012

7 USO DE RATONES Genética/bioquímica y fisiológicamente similares Habilidad para manipular su genoma Rápida reproducción Mínima variabilidad biológica Disponibilidad de histología postmortem VENTAJAS

8 USO DE RATONES Genética/bioquímica y fisiológicamente similares Habilidad para manipular su genoma Rápida reproducción Mínima variabilidad biológica Disponibilidad de histología postmortem Diferencias propias de la especie Diferente talla/ ciclo vital/morfología de los órganos Actividad de la telomerasa Escaso desarrollo de metástasis o en localizaciones distintas Diferencias en vías de señalización y metabolismo Distinto microambiente y sistema inmune VENTAJAS LIMITACIONES

9 Ligadura parcial de la Vena Porta Fácil, reproducible y de bajo coste Desarrollo de HTP muy rápido (máx 24h) Una semana tras la LPVP, desarrollo completo del sme HTP (circulación híperdinámica, shunts porto-sistémicos) Sección rama de la Vena Ileocólica Caracterizado en LPVP y BDL La severidad de la hemorragia depende del grado de hipertensión portal y del tamaño de la rama seccionada Buen modelo para testar drogas vasoactivas en condiciones hipovolémicas Abraldes et al. World J Gastroenterol 2006 HIPERTENSIÓN PORTAL HEMORRAGIA POR HIPERTENSIÓN PORTAL COMPLICACIONES DE LA CIRROSIS

10 COMPLICACIONES DE LA CIRROSIS / FIBROSIS Shunt Portocava en ratas Bypass portosistémico sin fallo hepático Cambios comportamiento Reversible con tratamiento anti-EH Buen modelo para estudio EH y desarrollo de nuevos fármacos Díaz-Gómez et al. Rev Esp Enferm Dig. 2011 ENCEFALOPATIA HEPÁTICA FIBROSIS POR ALCOHOL Modelo Lieber–DeCarli Reproduce la mayoría de los rasgos patológicos de la enfermedad hepática por alcohol Dieta semilíquida que aporta etanol como el 36% de las calorías totales Ad libitum como única fuete de alimento y líquido Fibrosis pericelular y perivenular progresiva Aparición de cirrosis en 1/3 de los animales después de una exposición tras 1-3 años.

11 FIBROSIS Necrosis centro-lobulillar aguda Respuesta reparadora inmediata Reclutamiento de células inflamatorias Incremento de matriz extracelular Fibrosis significativa tras 2-4 semanas Cirrosis micronodular en 12 semanas Administración ip / inhalación DEN (Diethylnitrosamine) + CCl 4 reproduce la secuencia daño hepático / fibrosis / transformación maligna Fibrosis periportal Cirrosis macronodular en 12 semanas Administration: i.p. / agua TETRACLORURO DE CARBONOTIOACETAMIDA (TAA) Abraldes et al. World J Gastroenterol 2006

12 FIBROSIS Cirrosis biliar primaria. Especialmente apropiado en ratas (no tienen vesícula biliar) Desarrollo de fibrosis-cirrosis biliar en 4-6 s Proliferación colangiocitos y fibrosis portal Demuestra la importancia a de los miofibroblastos periportales Concanavalin A Injección iv durante 20 semanas Fibrosis centrilobular y perisinusoidal Schistosoma mansoni Exposición percutanea produce granulomas y fibrosis periportal Arias M et al. BMC Gastroenterology 2003 LIGADURA COLÉDOCOINMUNOLOGICAMENTE MEDIADA

13 MANIPULACIÓN GENÉTICA Gen de interés Pérdida de funciónGanancia de función Knock-downKnock-out TransgénicoKnock-in RNAi Control Espacial & Temporal? NoSí Conventional knockout Reversible? Cambio esporádico? Inducible system Knock-out condicional Virus-mediated delivery No Sí NoSí No Sí Control Espacial & Temporal? Expresión Tejido específica? Condicional (Cre-Lox) Inducible (Tet) Transgénico con promotor ubicuo Transgenico con promotor Tejido- específico Knockin Convencional Sí

14 FIBROSIS RATONES KNOCK OUT ATP-binding cassette (ABC) B4 (ABCB4 -/- ) Defecto en el transporte de fosfolípidos desde los hepatocitos al luz canalicular Desarrollo espontáneo de fibrosis LIM homeobox gene (Lhx) 2 (LHX2 -/- ) Ratones deficientes en LHX2 desarrollan fibrosis hepática espontánea y progresiva durante el desarrollo embrionario (día 14) semanas del nacimiento El gen de interés se reemplaza (knock out) mediante selección antibiótica (Neomicina) Inyección embrión y Reproducción

15 COMBINACIONES Hepatotoxinas: CCl4/TAA con Modificación genética tejido específica (sistema Cre LoxP) La deleción del gen Atg7 específicamente en HSC aminora el desarrollo de fibrosis tras provocación daño hepático con hepatotoxinas. PROMOTOR LOX GFAP Atg7 CRE Deleción gen interés en celulas estrelladas GFAP-creAtg7 F /F Homocigotos Atg7 flox/flox GFAP-Cre (Knockout Atg7 específicamente en células estrelladas) FIBROSIS Hernandez-Gea et al. Gastroenterology 2012 LOX PROMOTOR

16 FIBROSIS RATONES TRANSGÉNICOS Sobreexpresión de Tgf-β1 en hepatocitos (ALBUMIN-Promoter) Sobreexpresión de PDGF-C e n hepatocitos Cambios morfológicos a las 2 semanas de edad con fibrosis prominente a las 6 semanas HCC entre 6 meses-1 año. Reproduce los pasos de desarrollo de HCC que ocurren en humanos (esteatosis, fibrosis, displasia, neoangiogenesis y malignización) Doyle A et al.Transgenic Res (2012)

17 HEPATOCARCINOMA DOBLE TRANSGÉNICO Myc/TGFα TGFa bajo el promotor metalotionina. Myc bajo el promotor albúmina 20% de los ratones transgénicos para ambos genes desarrollan HCC a los 4 meses y el 100% a los 8-10 meses. Co-expresión de Myc y TGFa induce tumores con alto grado de inestabilidad genética, aneuplodia y alta proliferación similar a los HCC de mal pronóstico Sobreexpressión hepática de linfotoxinas α y β Selectivamente en hepatocitos Hepatitis crónica a los 9 meses HCC a los 12 meses Johannes Haybaeck et al. Cell 2009 ControlLTαβ Factor VM et al. J Biol Chem 1998

18 TRANSGÉNICOS CONSTITUTIONALES LIMITACIONES Letalidad embrionaria / infertilidad El gen alterado puede ser vital para el desarrollo normal Variabilidad en el patrón de expresión Poco control sobre el sitio de integración y el nº copias del DNA insertado Puede que la proteína truncada todavía retenga actividad biológica No mimetiza la secuencia de eventos presentes en la tumorogenesis espontánea Mutación esta presente en todas las células alteradas y desde el principio El transgen se integra en los dos alelos del genoma del animal Tanto las células tumorales como estromales expresan el transgen Disponibilidad limitada de promotores tejido-específico

19 HEPATOCARCINOMA TRANSGÉNICOS INDUCIBLES Raton transgénico con delección del oncogen Myc específica en hígado e inducible Proteína tTA bajo el control del promotor LAP (Liver activator promotor) capaz de unirse en hígado a celulas que expresan secuencia específica TetO Myc bajo el control de protor TetO-CMV El tratamiento con Doxicilina en estos animales previene la expressión de Myc. Discontinuación de doxiclinia a las 3 semanas de edad activa la expressión de Myc (Tet-Off) y los ratones que expresan Myc desarrollan HCC a las 12 semanas TetRVP16 TetOCMV Myc Expresión gen interés TetRVP16 No expresión LAP Doxi LAP Shachaf CM et al. Nature 2004

20 Firma genética generada en hepatocitos primarios de ratón basada en la expresión temporal del gen TGFβ es capaz de identificar distintos subgrupos de HCC en humanos INTEGRATIVE ONCOGENOMIC (MICE TO HUMAN) Coulouarn C et al. Hepatology 2008

21 INTEGRATIVE ONCOGENOMIC (MICE TO HUMAN) En humanos los dos subgrupos generados presentan diferencias en supervivencia, origen de células tumorales (hepatoblastos vs hepatocitos), expresión c-Met/HGF, HBV status. Coulouarn C et al. Hepatology 2008

22 IDENTIFICACIÓN DE NUEVOS ONCOGENES A nálisis de expresión para comparar anomalías genómicas (amplicones) entre ratón y humano. Los eventos recurrentes sirven como filtro para identificar los genes candidatos. Una vez identificados se evalúa su funcionalidad en cuanto actividad tumoral o metastásica p53−/− con sobreexpresión de Myc (marcage GPP) Identificación de oncogenes cIAP1 y Yap Zender L et al. Cell. 2006

23 XENOGRAFTS Inyección de células tumorales humanas o fragmentos de tumor de forma subcutánea u ortotópica en ratones inmunodeficientes Crecimiento tumoral con el soporte del estroma y vasculatura murina Formación de nódulo tumoral en 2–6 semanas tras implantación Pilar principal de los estudios preclínicos para el desarrollo in vivo de nuevos medicamentos Células tumorales en cultivo Inyección subcutánea de células

24 DESARROLLO NUEVOS TRATAMIENTOS Sharpless & DePinho. Nature Reviews Drug Discovery 2006 Tras inyectar células tumorales, los ratones se tratan con el compuesto de interés durante 2-6 semanas tiempo durante el cual se desarrolla el tumor. Es estudio es positivo si el compuesto de interés reduce le crecimiento tumoral Cultivo de células tumorales Inyección ≈ 10 6 células en ratón inmunodeprimido Tratamiento durante 2-6 semanas

25 XENOGRAFTS Fácil uso y bajo coste Células tumorales representativas de tumores reales (complejidad genética) Evaluación del volumen tumoral y crecimiento tras tratamiento Nuevas terapias: diferentes dosis esquemas de tratamiento en el mismo set de células Gran ayuda para priorizar los compuestos que pasaran a Fase I Inmunosupresión huésped SCID mice (severe combined Immunodeficience) tienen defectos en los mecanismos de reparación del DNA Nude mice ( alteración timica ): fragilidad general que limita su tolerancia y resistencia a fármacos No sirve para evaluar tratamientos inmunomoduladores No recapitulan completamente la heterogeneidad intratumoral ni el microambiente Eficacia quimioterapéutica es sensible pero poco específica Hasta 89% de fármacos que superan los estudios preclínicos nunca llegan a ser aprobados VENTAJASDESVENTAJAS

26 QUIMERAS / TRASPLANTE HUMAN-IN-MOUSE Células cancerígenas humanas se implantan en un tejido adyacente normal Fácil/ Rápido/ Coste efectivo Valoración interacciones tumor-estroma (quimeras) Desarrollo y validación de nuevos fármacos Heyer J et al. Nature Reviews Cancer. 2010

27 MODELO ANIMAL IDEAL GEMM Biología Molecular Fisiopatología Desarrollo Fármacos Quimioresistencia Análisis genoma Perfil molecular Histopatología Estudios Imagen in vivo Carcinogénesis Screening Identificación Biomarcadores Determinantes de progresión metastásica Influencia factores ambientales

28 CONCLUSIONES El perfecto modelo animal todavía esta por generar En cáncer, no existe el modelo que recapitule todos los estadios del desarrollo del tumor Diferencias interespecies obligan a seguir utilizando material humano Entender las ventajas y limitaciones de cada modelo es necesario para maximizar la rentabilidad de los modelos disponibles