Fundamentos de la Proteómica Clásica MAPAS DE PÉPTIDOS. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS A PARTIR DE PÉPTIDOS Alberto Jorge García Laboratorio de Qu í mica.

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1 Fundamentos de la Proteómica Clásica MAPAS DE PÉPTIDOS. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS A PARTIR DE PÉPTIDOS Alberto Jorge García Laboratorio de Qu í mica de Prote í nas y Prote ó mica CBM-SO. CSIC-UAM Curso de doctorado “Estructura y Función de Macromoléculas” ajorge@cbm.uam.es TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS

2 Aproximaciones Clásicas para el Análisis del Proteoma Geles 1D ó 2D Digestión bandas (1D) o spots (2D) Extracción de péptidos Transferencia a PVDF Degradación de Edman Secuenciación N-terminal Búsqueda DB Identificación proteína Análisis PTMs “De Novo” nano-ESI-MS/MS Secuenciación manual MALDI-TOF (PMF) LC-ESI-MS/MS Secuenciación automática Separación HPLC colección de fracciones Desalado

3 PROTEÍNA: PROTEÍNA: Conjunto de aminoácidos ordenados en una secuencia específica para dar lugar a una propiedad o actividad definida Para la identificación de una proteína se necesita obtener información única de la misma que sea única para esa proteína en particular pI ó MW no siempre permiten hacer una asignación única ? Identificación de una proteína

4 Técnicas Clásicas en Química de Proteínas ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS 1. Hidrólisis de péptidos o proteínas Ácida (6M HCl, 110 ºC, 18-24h) Alcalina (NaOH 4.2N) 2.Separación y detección de los aminoácidos por HPLC 3. Mediante comparación con patrones de aminoácidos: Identificación tiempo de retención en la columna Cuantificación área de los picos R-CO-NH-R´ + H 2 O R-COOH + 2 HN-R´

5 Permite conocer la composición de aminoácidos de una proteína pero no la secuencia de la misma Técnicas Clásicas en Química de Proteínas

6 DEGRADACIÓN DE EDMAN (1950)  Las proteínas son “degradadas” en su extremo N-terminal mediante el acoplamiento de feniltioisocianato (PITC)  La reacción se divide en tres etapas: - Acoplamiento - Ruptura - Conversión  Durante un ciclo de reacción el residuo N-term. del polipéptido es cortado y analizado por HPLC  Queda libre el extremo N-term. del segundo residuo susceptible de un nuevo ciclo  Se obtiene una secuencia de aminoácidos con tantos residuos como ciclos de reacción

7 N-term-aa 1 -aa 2 -aa 3 -aa 4 -aa 5 -aa 6 -C-term Técnicas Clásicas en Química de Proteínas N-term-aa 2 -aa 3 -aa 4 -aa 5 -aa 6 -C-term PTH-aa 1 + CICLO 1 N-term-aa 3 -aa 4 -aa 5 -aa 6 -C-term PTH-aa 2 + CICLO 2 N-term-aa 4 -aa 5 -aa 6 -C-term PTH-aa 3 + CICLO 3 N-term-aa 5 -aa 6 -C-term PTH-aa 4 + CICLO 4...

8 S-fosfo Técnicas Clásicas en Química de Proteínas Separación cromatográfica de una mezcla patrón de PTH-aa s

9 Técnicas Clásicas en Química de Proteínas  Vigentes hasta hace poco más de 4-5 años  Identificación “textual” de la proteína  Estudios muy costosos  Pormenorizados  Muy lentos  Mantenimiento complicado  Reacciones secundarias no deseables  Información limitada

10 Peptide Mass Fingerprinting (PMF) EVOLUCIÓN HISTÓRICA velocidad de análisis  Necesidad de desarrollar una técnica que permitiese aumentar la velocidad de análisis de las proteínas, cuyo objetivo inicial fue determinar de una forma rápida cuáles eran las proteínas más abundantes de una muestra que, generalmente, no son las de interés métodos de ionización 20 kDa cantidad de muestra  Los métodos de ionización empleados entonces en espectrometría de masas (FAB y PDMS) eran incapaces de producir iones de proteínas mayores de 20 kDa y necesitaban gran cantidad de muestra MALDI y ESI inferiores al pmol 100 kDa  El desarrollo, a principios de los 90, de técnicas de ionización suave (MALDI y ESI) que permitían el análisis de cantidades menores (inferiores al pmol) y podían trabajar con proteínas de hasta 100 kDa tuvo un gran impacto en el PMF

11 Peptide Mass Fingerprinting (PMF) HIPÓTESIS Si se corta una proteína de forma predecible, los tamaños de las piezas obtenidas conformarán la “huella peptídica” de esa proteína Si cada proteína presente en una DB puede ser cortada “in silico” de la misma forma, la huella peptídica permitirá la identificación de la proteína

12 Peptide Mass Fingerprinting (PMF) PROCEDIMIENTO digestión enzimática  El “corte” de la proteína se realiza mediante digestión enzimática utilizando proteasas que rompen la proteína generando un determinado número de péptidos única  La “huella peptídica” de una proteína dependerá de la proteasa empleada, pero es única para cada una de ellas Tripsina Tripsina Corta R-X y K-X excepto si X=P

13 Peptide Mass Fingerprinting (PMF) >sp|P02769|ALBU_BOVIN Serum albumin precursor (Allergen Bos d 6) (BSA) – Bos taurus (Bovine) MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPFDEHVKLVNELTEFAKTCVADESH AGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEPERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLY EIARRHPYFYAPELLYYANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLASSARQRLRCASIQKFGERALKAWSVARLSQK FPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKECCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLT ADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRRHPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEPQNLI KQNCDQFEKLGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLILNRLCVLHEKTPVS EKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAF VDKCCAADDKEACFAVEGPKLVVSTQTALA Secuencia Parcial ParcialPM M+H + M+H +Secuencia Parcial ParcialSecuencia Secuencia PM M+H + M+H +PM PM

14 Peptide Mass Fingerprinting (PMF) Compara esas masas teóricas con las masas observadas experimentalmente Produce una digestión teórica de todas las proteínas presentes en una DB con una enzima específica Asigna una puntuación (score) a los péptidos/proteínas que coinciden en función del grado de coincidencia

15 Peptide Mass Fingerprinting (PMF) MAPAS TEÓRICOS MAPA EXPERIMENTAL Cortesía de Bruker Daltonics

16 Peptide Mass Fingerprinting (PMF) Mapa MALDI-TOF de un digerido en gel de BSA

17 En la actualidad hay disponibles en la web varios motores de búsqueda: Búsqueda en las Bases de Datos MASCOT MASCOT : http://matrixscience.com ProFound : ProFound : http://129.85.19.192/profound_bin/WebProFound.exe MS-Fit MS-Fit : http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml4.0/msfit.htm PeptIdent PeptIdent : http://ua.expasy.org/tools/peptident.html Aldente Aldente : http://ua.expasy.org/tools/aldente.html

18 Búsqueda en las Bases de Datos

19 Parámetros de búsqueda: BASES DE DATOS

20 - DB con bajo nivel de redundancia - Gran nº de anotaciones (función, variantes de secuencia, etc)SwissProt - DB de proteínas no idénticas - Diseñada específicamente para aplicaciones de MSMSDB - DB de ác. nucléicos y proteínas no idénticas - Las entradas han sido compiladas a partir de traducciones de GenBank, PIR, SWISS-PROT, PRF y PDB - Es la mayor y la que más frecuentemente se actualizaNCBInr dbEST dbEST: DB de “Expressed Sequence Tags” Random: Random: DB de secuencias aleatorias. Utilizada para la verificación estadística de los resultados OWL: OWL: DB de proteínas no idénticas. Sin actualizar desde 1999 No utilizadas para PMF:

21 Parámetros de búsqueda: TAXONOMÍA

22 Permite limitar la búsqueda a entradas de un grupo de especies o una especie en particular aumentando la velocidad de la búsqueda Inconveniente: Inconveniente: Falta de un sistema riguroso para especificar la taxonomía en las DB principales problemas Los principales problemas son: El texto de una entrada puede no especificar la taxonomía Hay múltiples nombres para una única especie (homo sapiens, human, man) Existen nombres con errores (homo sapeins) Reclasificación continua de especies En las DBnr, una única entrada puede representar secuencias idénticas pertenecientes a múltiples especies Parámetros de búsqueda: TAXONOMÍA ¡!

23 Parámetros de búsqueda: ENZIMA NameCleave Don't cleave N or C term TrypsinKRPCTERM Arg-CRPCTERM Asp-NBD NTERM Asp-N_ambicDE NTERM ChymotrypsinFYWLPCTERM CNBrM CTERM Formic_acidD CTERM Lys-CKPCTERM Lys-C/PK CTERM PepsinAFL CTERM Tryp-CNBrKRMPCTERM TrypChymoFYWLKRPCTERM Trypsin/PKR CTERM V8-DEBDEZPCTERM V8-EEZPCTERM CNBr+Trypsin M CTERM KRPCTERM “None” Para péptidos que no se han originado a partir de una digestión enzimática (ej. MHC) No es una buena elección para PMF “SemiTrypsin” Para péptidos producto de un doble corte inespecífico

24 Parámetros de búsqueda: MISSED CLEAVAGES Es conveniente no especificar más de 2 cortes parciales ya que el aumento supone incrementar el número de péptidos a los que se enfrentarán los datos experimentales con lo cual: Aumenta el tiempo de búsqueda Aumenta el número de asignaciones aleatorias Disminuye la discriminación y la puntuación final¡!

25 Parámetros de búsqueda: MODIFICACIONES

26 FIJAS VARIABLES Modificación que puede o no estar presente Modificación aplicada universalmente No produce aumento en el número de péptidos Ej. Carbamidomethyl (C) + 57 Da C 103 Da 160 Da Se buscan todas las posibles combinaciones para encontrar la mejor asignación Parámetros de búsqueda: MODIFICACIONES Ej. Oxidation (M) + 16 Da AIMCTHDMEYWMKAIMCTHDMEYWMK AIMCTHDMEYWMKAIMCTHDMEYWMK AIMCTHDMEYWMKAIMCTHDMEYWMK AIMCTHDMEYWMKAIMCTHDMEYWMK Aumenta el tiempo de búsqueda Aumenta el número de asignaciones aleatorias Disminuye la discriminación y la puntuación final ¡! Cada modif. variable puede generar varios péptidos adicionales para ser testados:

27 Parámetros de búsqueda: MODIFICACIONES Modificaciones causadas por la preparación de la muestra: Coomassie / Sypro Plata1-D Variables 2-D Met oxidada (+16 Da) Met oxidada (+16 Da) C-carbamidometilada (+ 57 Da) Met oxidada (+16 Da) C-carbamidometilada (+ 57 Da) Variables Fijas Fijas Met oxidada (+16Da) Propionamida (+71 Da) Propionamida (+71 Da) C-betamercapto (+76 Da) C-betamercapto (+76 Da) C-carbamidometilada (+57 Da) - - - - - - -

28 Parámetros de búsqueda: MODIFICACIONES Modificaciones Post-traduccionales:  Juegan un papel fundamental en la funcionalidad de las proteínas Acetilación N-terminal: +42 Da Induce un incremento en la ionización del péptido produciendo picos muy intensos  Las más comunes son: Fosforilación (S, T, Y): +80 Da Dificulta la ionización. Es más difícil de detectar por PMF  Si estamos seguros de que nuestra proteína está modificada podemos: Seleccionar la modificación como variable (menos recomendable) Buscar el péptido modificado en el mapa Deberá aparecer con un desplazamiento en m/z equivalente a la modificación

29 Parámetros de búsqueda: MW DE LA PROTEÍNA

30 ¡! La mayoría de las entradas en las DB corresponden a la forma menos procesada de la proteína Permite encontrar asignaciones correspondientes a:  Proteínas de menor MW  Proteínas de mayor MW Extendiendo la secuencia como máximo una longitud igual a MW especificado Si se restringe la búsqueda a un rango muy estrecho en torno al MW Alta probabilidad de que se produzca una asignación errónea límite superiorMWMASCOT

31 Parámetros de búsqueda: MW DE LA PROTEÍNA INS_BOVIN (SwissProt) PRECURSOR (incl. pépt. señal y conectores) MW 11394 Da Procesamiento posterior a la traducción INSULINA (MW 5734 Da) Ejemplo : 5734 Da x 2 = 11468 Da > 11394 Da Límite superior de la búsqueda en MASCOT superior al MW de la forma menos procesada de la proteína Alta probabilidad de que la asignación sea correcta

32 Parámetros de búsqueda: TOLERANCIA DE LOS PÉPTIDOS Es el margen de error permitido Es el margen de error permitido para las masas experimentales de los péptidos

33 Parámetros de búsqueda: TOLERANCIA DE LOS PÉPTIDOS Unidades: mmu mmu unidades absolutas de mili-masa (ej. unidades de.001 Da) Da Da unidades absolutas de Da ppm ppm fracción expresada como partes por millón % % fracción expresada como porcentaje búsqueda de un péptido de 1000.00 Da  100 ppm se busca entre 999.90 Da y 1000.10 Da La tolerancia permitida dependerá de la exactitud de masa del equipo y de la calibración exactitudtolerancia probabilidad buena asignación

34 Parámetros de búsqueda: VALORES DE MASAS Modo Lineal Modo Reflector Monoisotópico (mayor resolución) Average

35 Parámetros de búsqueda: DATA FILE OR QUERY Data file Data file: Formato ASCII (texto simple). Si se especifica, MASCOT ignora Query

36 Parámetros de búsqueda: LISTA DE MASAS Para PMF se emplea una lista de masas donde no se tiene en cuenta la intensidad no se tiene en cuenta la intensidad de los picos ¡! alta sensibilidad Principalmente si se trabaja a alta sensibilidad donde la intensidad de los péptidos es semejante a la de los contaminantes (matriz, queratinas, autolisis de tripsina)¡Inconveniente! Ej. Proteína 20 KDa. Digestión triptica20-40 péptidos Lista de 100 masas 60-80 péptidos son ruido o contaminantes Probabilidad de asignaciones aleatorias

37 Parámetros de búsqueda: LISTA DE MASAS Método óptimo:  Buen rendimiento de digestión  Correcta manipulación de la muestra  Equipo que permita buena resolución y exactitud de masa  Adecuada calibración  Adquisición del espectro idónea  Conocer las masas de los contaminantes

38 Parámetros de búsqueda: OVERVIEW AND REPORT HITS Incluye en los resultados una tabla descriptiva Número máximo de resultados a mostrar AUTO AUTO: muestra sólo las proteínas con puntuación significativa

39 Ejemplo real Digerido en gel de BSA

40 Start Search...

41 RESULTADOS Albumin (Bos taurus) Zona de incertidumbre

42 RESULTADOS Index

43 Results List RESULTADOS

44 RESULTADOS Overview Table gi|418694 gi|30794280

45 RESULTADOS Protein View

46 RESULTADOS

47 Interpretación de los Resultados He identificado una proteína pero... ¿Es realmente correcta la identificación? Análisis cuidadoso de los resultados Coincidencia del resultado empleando distintos motores de búsqueda Coincidencia del resultado haciendo la digestión con distintas proteasas Las masas asignadas a la proteína, ¿son las más abundantes del espectro? Del total de masas experimentales, ¿cuántas “encajan” con la proteína? ¿Cuánto se aleja nuestro resultado de la zona de incertidumbre?

48 Interpretación de los Resultados ¿El resultado apoya lo que se conoce previamente? ¿MW esp. es de una prot. degradada?... Coincidencia de la especie, tejido, compartimento subcelular, etc Coincidencia del MW Precauciones: MW obs. > MW esp. MW obs. < MW esp. En DB, forma menos procesada ¿La prot. es oligomérica y observamos una subunidad?

49 Ventajas y Limitaciones del PMF VENTAJAS LIMITACIONES Análisis rápido y con bajo coste Alta sensibilidad Aplicable para un elevado número de muestras La proteína debe estar en la DB o presentar un alto grado de homología con proteínas presentes para poder ser identificada No aplicable para proteínas menores de 15 kDa o proteínas con alto número de modificaciones Dificil identificación de mezclas de proteínas

50 Aplicaciones  Identificación de proteínas  Determinación de la identidad de una proteína asociada con una determinada actividad observada  Identificación de sustratos de proteínas quinasas  Determinación de la localización subcelular  Identificación de complejos de interacción

51 Protein Identification General  Yates, JR, 3rd, Database searching using mass spectrometry data. Electrophoresis, 19(6) 893-900 (1998).  Bleasby, AJ and Wootton, JC, Construction of validated, non-redundant composite protein sequence databases. Protein Eng., 3(3) 153-9 (1990). Peptide Mass Fingerprint  Pappin, DJC, Hojrup, P and Bleasby, AJ, Rapid identification of proteins by peptide-mass fingerprinting. Curr. Biol., 3(6) 327-32 (1993).  James, P, Quadroni, M, Carafoli, E and Gonnet, G, Protein identification in DNA databases by peptide mass fingerprinting. Protein Sci, 3(8) 1347-50 (1994). Sequence Query  Mann, M and Wilm, M, Error-tolerant identification of peptides in sequence databases by peptide sequence tags. Anal Chem, 66(24) 4390-9 (1994).  Pappin, DJC, Rahman, D, Hansen, HF, Bartlet-Jones, M, Jeffery, W and Bleasby, AJ, Chemistry, mass spectrometry and peptide-mass databases: Evolution of methods for the rapid identification and mapping of cellular proteins. Mass Spectrom. Biol. Sci., 135-50 (1996). Bibliografía