ESCUELA POLITECNICA DEL EJÉRCITO

Presentación del tema: "ESCUELA POLITECNICA DEL EJÉRCITO"— Transcripción de la presentación:

1 ESCUELA POLITECNICA DEL EJÉRCITO
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA “IDENTIFICACIÓN DE REARREGLOS CROMOSÓMICOS ASOCIADOS CON TUMORES SÓLIDOS A PARTIR DE MUESTRAS DE TEJIDOS EMBEBIDOS EN PARAFINA (FFPE) Y DE TEJIDOS EN CONGELACIÓN (TOC), MEDIANTE LA APLICACIÓN DE LA TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN IN SITU CON FLUORESCENCIA (FISH)”. Previa a la obtención de Grado Académico o Título de: INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA ELABORADO POR: SULLY ESTEFANÍA MÁRQUEZ AGUILAR

2 INTRODUCCIÓN OBJETIVOS MATERIALES Y METODOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA AGRADECIMIENTOS

3 INTRODUCCIÓN Clasificación de los genes GENES SUPRESORES DE TUMORES
Control fisiológico en la proliferación celular Caretakers MLH1 (Lynch syndrome) PROTO ONCOGENES Gatekeepers PTEN Landscapers Activación oncogénica Mecanismos de inactivación: Metilación del ADN y sellado genómico Inestabilidad cromosómica (CIN). Fuente: Fuente.

4 Crecimiento anormal (alteraciones ADN )
INTRODUCCIÓN CÁNCER INICIACIÓN Crecimiento anormal (alteraciones ADN ) Cuatro tipos principales: Carcinomas (mama) Sarcomas (tejido conectivo ) Leucemias Linfomas PROMOCIÓN Alteración de procesos celulares fuertemente regulados: D, P, MCP PROGRESIÓN Fuente: PROPIEDADES Indiferenciación Habilidades proliferativas Checkpoints Reparación del ADN Inmortalidad, angiogénesis, metabolismo alterado, inestabilidad genómica Señalización anormal Movimiento Dividirse rápidamente INVASIÓN Y METÁSTASIS TUMOR Fuente: Benigno Maligno

5 INTRODUCCIÓN TUMORES SÓLIDOS TIPO DE TUMOR SÓLIDO CARACT.
REARREGLO CROMOS. OTROS Sarcoma de Ewing Familia (ESFT) Células redondas pequeño tamaño con mínima diferenciación. t(11;22) EWS/FL1 ERG t(21;22) ETV1 t(7; 22) EIA t(17;22) Cáncer de Mama Familia (EGFR) Amplificación Her2/neu Linfoma de Burkitt Células B se infiltran tejidos nodales (patrón difuso). t(8;14) C-MYC/IgH t(8;22), t(2;8)

6 INTRODUCCIÓN TUMORES SÓLIDOS TIPO DE TUMOR CARACT. REARREGLO CROMOS.
OTROS Neuroblastoma 2do más frecuente en niños < a 1 año de edad. Células pequeñas redondas y azules. Amplificación N-MYC (20%) Delec. en el brazo p cromos. 1 Ganancia en el brazo q cromos. 17 Linfoma Anaplásico ALK (quinasa de linfoma anaplásico) y proteínas citotóxicas. t(2;5) ALK/NPM inv(2)(p23;q15) t(1;2)(q25;p23)

7 Sonda de ADN marcada con fluorescencia
INTRODUCCIÓN FISH Etapas Híbrido (la citogenética y la biología molecular). Detección de secuencias concretas de ácidos nucleicos (ADN o ARN)→ el empleo de sondas específicas marcadas con un fluorocromo. Los 2 componentes principales : Determinación de anormalidades recurrentes y rearreglos (diagnóstico y pronóstico). 1.Pretratamiento 2.Hibridación 4.Contratinción y visualización del ADN Sonda de ADN marcada con fluorescencia Secuencia diana 3.Lavados post-hibridación 2.Denaturación Fuente:

8 INTRODUCCIÓN TIPOS DE SONDAS Sondas Centroméricas
Sondas Pintado Cromosómico Sondas Teloméricas Sondas de Locus Específico Sondas de Fusión Sondas Dual Color Dual Fusión Sondas de Separación o Split

9 OBJETIVOS INTRODUCCIÓN MATERIALES Y METODOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA AGRADECIMIENTOS

10 OBJETIVOS General Específicos
Identificar rearreglos cromosómicos asociados con tumores sólidos en tejidos embebidos en parafina y en tejidos en congelación mediante la aplicación de la técnica de hibridación in situ con fluorescencia (FISH). Analizar muestras de tumores sólidos, recolectadas desde marzo del 2011 hasta marzo del 2012, aplicando la técnica de hibridación in situ con fluorescencia (FISH) en tejidos en congelación y en tejidos embebidos en parafina. Identificar los rearreglos cromosómicos asociados a tumores específicos en cada neoplasia en estudio mediante la valoración de sus núcleos. Cuantificar la correlación entre los tumores en estudio con las variables sexo, edad, localización del tumor. Comparar el diagnóstico por FISH con el histológico. General Específicos

11 MATERIALES Y MÉTODOS INTRODUCCIÓN OBJETIVOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA AGRADECIMIENTOS

12 TEJIDOS EMBEBIDOS EN PARAFINA
MATERIALES Y MÉTODOS TEJIDOS EMBEBIDOS EN PARAFINA

13 TEJIDOS EN CONGELACIÓN
MATERIALES Y MÉTODOS TEJIDOS EN CONGELACIÓN

14 MATERIALES Y MÉTODOS VALORACIÓN DE NÚCLEOS
HER2/neu se evaluaron 20 núcleos Núcleos no sobrelapados 200 núcleos

15 MATERIALES Y MÉTODOS VALORACIÓN DE NÚCLEOS TUMOR SÓLIDO SONDA
REARREGLO CROMOS POSITIVO NEGATIVO Sarcoma de Ewing Sonda Vysis LSI EWSR1 Dual Color Break Apart t(11;22) Neuroblastoma Sonda Vysis LSI N-MYC (2p24) spectrum green /CEP 2 spectrum orange. Amplificación N-MYC Linfoma de Burkitt Sonda Vysis LSI IGH/MYC dual-Color Dual Fusion t(8;14)

16 Amplificación HER2/neu
MATERIALES Y MÉTODOS VALORACIÓN DE NÚCLEOS TUMOR SÓLIDO SONDA REARREGLO CROMOS POSITIVO NEGATIVO Cáncer de Mama Sonda HER2 /neu CEP17 PathVysion Amplificación HER2/neu Linfoma Anaplásico Sonda Vysis LSI ALK Dual Color, Break Apart Rearrangement. t(2;5)

17 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA AGRADECIMIENTOS

18 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Detección de los rearreglos cromosómicos en los diferentes tipos de tumores sólidos Sarcoma de Ewing Figura 3.1. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de fémur con translocación 22q12 positiva en Sarcoma de Ewing (TOC) Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Figura 3.2. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de origen retroperitoneal con translocación 22q12 positiva en Sarcoma de Ewing (FFPE) Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Diagnóstico definitivo , EWSR1/FL1(mejor pronóstico ) RT-PCR y FISH 5 (Berková et al. (2008))18 Qian et al. 16 Yamaguchi et al. (2005), nuevas sondas 90%.

19 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Linfoma de Burkitt Figura 3.3. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de ganglio inguinal con translocación 8q14 negativa en Linfoma de Burkitt (FFPE)Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Figura 3.4. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de ganglio con translocación 8q14 positiva en Linfoma de Burkitt (TOC)Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Gen C-MYC (iniciación de un proceso tumoral), t(8;14) pacientes adultos, revaloración (resultado desfavorable) Belaud-Rotureau et al. (2002), 4 t(11;14)(q13;q32)LCM 3 t(8;14)(q24;q32)LB, Moon et al. (2008) translocación doble del cromosoma 14

20 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cáncer de Mama Figura 3.5. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de mama con amplificación positiva para el gen HER2/neu en Cáncer de Mama (FFPE) Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Figura 3.6. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de mama con amplificación negativa para el gen HER2/neu en Cáncer de Mama (FFPE). Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Tumor agresivo, con mayor resistencia a los tratamientos t< supervivencia Prevenir efectos cardiotóxicos . FISH vs Inmuno 50 Sui et al, 2009). 41 Su et al, (2011)

21 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Neuroblastoma Figura 3.7. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de origen retroperitoneal con amplificación negativa del gen N-MYC en Neuroblastoma (FFPE) Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Figura 3.8. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de origen retroperitoneal con amplificación negativa del gen N-MYC en Neuroblastoma (TOC) Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Gen N-MYC (altamente agresivo) Presencia de metástasis y un pronóstico pobre. Sartelet et al. (2002)97 FISH vs SB/PCR amplificación heterogénea , Abdalla et al. (2009) 30, diagnosticado en todos los casos de tumores neuroblasticos periféricos ≠s

22 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Otros tumores sólidos Figura 3.9. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de ganglio retroperitoneal con translocación 2p23 ALK negativa en Linfoma No Hodking de células pequeñas (TOC) Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Figura Fotografía de núcleos en interfase de una muestra retroocular con translocación 2p23 ALK negativa en Retinoblastoma (TOC) Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Gen ALK se asocia con el linfoma anaplásico de células grandes. ALK+(quimioterapia) y ALK− no muy favorable. Li et al 22 FISH vs Imnumo 100% concordancia, Shin et al. (2003), 9 FISH (aspirados)

23 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.1 Información y resultados del análisis de las diferentes muestras de tumores sólidos empleados en el estudio (N° de muestra, edad y sexo del paciente, diagnóstico médico, técnica histopatológica, técnica de FISH, tipo de tejido, tiempo de almacenamiento, localización topográfica y los resultados) obtenidos desde Marzo 2011 hasta Enero 2012. N° de muestra Sexo Edad Localización topográfica Diagnóstico Resultado histopa- tológico Tipo de Tejido (TOC y FFPE) Tiempo de almacenamiento Translocación o amplificación esperada Result. FISH 1 M 21 Fémur Sarcoma Ewing PEANUT + TOC 22q12 2 65 Ganglio Inguinal Linfoma Burkitt FFPE 15 días 8q14 - 3 F 12 Tibia 4 56 Mama Carcinoma Ductal 301 días Her2-neu/CEP17 5 Suprarrenal Neuroblastoma 19 días N-MYC 6 17 Retroperitoneal 7 días 7 57 carcinoma Mutifocal 20 días 8 9 30 días 10 73 Paratoroides Linfoma No Hodgkin 2p23 ALK 11 Retroocular Linfoma No Hodking 14 Ganglio 13 34 Ganglio Retroperitoneal 15 16 68 Carcinoma ductal infiltrante mod. Diferenciado 47 Carcinoma ductal in situ extenso de alto grado 180 días 18 58 120 días 19 40 20 37 66 días

24 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tumor Sólido Heterogeneidad celular. González et al. (2010). Escasa disponibilidad . González et al. (2010). Rearreglos cromosómicos La evolución de la enfermedad. La valoración de la respuesta al tratamiento. FISH →mejorar el diagnóstico y monitoreo. Ventaja Tejidos (congelación,parafinados). La digestión PASO CLAVE. Tojo (2009). Tejido en congelación (100% )y parafinado (80%).

25 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Características Operativas Histopatología vs FISH Curva de ROC Tabla 3.7 Características operativas de la técnica de FISH comparada con la de Histopatología (gold standard) para los tumores sólidos mediante el software estadístico EPIDAT v3.1 (2012). CARACTERÍSTICA OPERATIVA VALOR IC (95%) Sensibilidad (%) 100,00 93,75 Especificidad (%) 33,33 2,49 64,17 Valor predictivo positivo (%) 50,00 22,38 77,62 Valor predictivo negativo (%) 87,50 Índice de Youden 0,33 0,07 0,60 Figura Curva de ROC de FISH vs. Histopatología (gold standard), obtenido mediante el software estadístico EPIDAT v3.1 (2012).

26 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
SENSIBILIDAD (100%) FISH (capacidad muy alta de detección, hibridación). Identifica  ESPECIFICIDAD (33,33%) Técnica histopatológica (análisis morfología). Técnica de FISH (locus específico). Variante ÍNDICE DE YOUDEN(0,33) Baja especificidad. VPN(100%) No tiene el rearreglo específico. VPP(50%) Técnica tendría poco poder definir la probabilidad. CURVA DE ROC (0,667) Capacidad discriminatoria menor.

27 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Comparación de Resultados Histopatología vs FISH McNemar P=0,0075 Sí hubo diferencias en los resultados Chi Cuadrado de independencia P=0.068 Independiente de la técnica histopatológica. Índice de Kappa κ=0,286 Concordancia baja Tabla 3.8 Resultados obtenidos mediante la Histopatología y la técnica de FISH.

28 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
VENTAJAS DE LA TÉCNICA FISH Estudio de células en interfase y tiene alta sensibilidad. No cultivo de tumores y Confirmación Disponibilidad de sondas comerciales Perspectiva médica Diagnóstico pronóstico de una enfermedad genética Investigación Mapeo genético Identificación de nuevos oncogenes FISH multiplex Decisión del tipo de tratamiento para combatir el cáncer Fotografía de una muestra de médula ósea en metafase con inv 16 negativa en leucemia mieloide aguda Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011).

29 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
DESVENTAJAS DE LA TÉCNICA FISH Su uso depende de la disponibilidad de sondas. Aporta información concreta dependiendo del tipo de sonda utilizada (screening). Alto coste económico. No en tejidos necróticos. No se pueden detectar varias alteraciones simultáneamente Fotografía de una muestra de neuroblastoma en interfase con amplificación N-MYC negativa. Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011).

30 CONCLUSIONES INTRODUCCIÓN OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA AGRADECIMIENTOS

31 CONCLUSIONES Se realizó análisis de 20 tumores sólidos aplicando FISH sondas de locus específico (rearreglos cromosómicos específicos). FISH permitió una adecuada identificación rearreglos cromosómicos esperados en TOC. Se evidenció en 3 SE, en 2 LB, en 4 NB, en 7 CM y 4 otros tumores sólidos (LNH). La comparación entre las técnicas, sesgo → histopatología (screening) mientras que FISH (locus específico) influyendo →cálculo de las caract. Oper. FISH sensibilidad del 100%, de especificidad 33,33%, VPP del 50%, VPN del 100% y un IJ de 0,33. Con la prueba Chi cuadrado de independencia (P=0,068), FISH independiente histopatológica pero al obtenerse una curva de ROC con un área 0,667 capacidad discriminatoria menor, (complemento) →un mejor diagnóstico de los rearreglos cromosómicos en tumores.

32 CONCLUSIONES Se obtuvo un valor de κ=0,286, (baja concordancia) FISH con respecto al estándar de oro, y prueba de McNemar P=0,0075, ≠s resultados. Sin embargo en aquellas muestras en las que se obtuvo un resultado (-) para el rearreglo cromosómico mediante la técnica en estudio, no significa que el diagnóstico histopatológico esté equivocado (otro tipo de alteración genética). La técnica FISH es la más utilizada para el estudio de tumores sólidos sobre todo cuando existe un diagnóstico indeterminado. Además la identificación de los rearreglos cromosómicos específicos en las neoplasias en estudio (pronóstico, tratamiento y monitoreo)→ gran importancia a nivel clínico.

33 RECOMENDACIONES INTRODUCCIÓN OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA AGRADECIMIENTOS

34 RECOMENDACIONES Para la comparación de técnicas se recomienda comparar a la técnica de FISH con sonda de locus específico con PCR o inmunohistoquímica (precisa). Se recomienda para futuras investigaciones aplicar la técnica RT-PCR en las muestras de tumores sólidos en estudio para complementar el diagnóstico (resultado negativo). Se recomienda utilizar la técnica FISH en aquellos casos en los que el cultivo de tumores presente dificultades (metafases, cariotipo y contaminación de las muestras). Se recomienda utilizar FISH para la detección de rearreglos asociados a tumores que pueden ser muy difíciles de diagnosticar únicamente por su morfología. Se recomienda utilizar FISH cuando el diagnóstico inmunohistoquímico indeterminado o equívoco (gen HER2/neu) en el cáncer de mama (paciente es positiva o negativa).

35 RECOMENDACIONES Utilizar FISH, para tomar la decisión (tratamiento) predecir la respuesta de los tumores a drogas usadas actualmente en la quimioterapia. Citogénetica convencional →cariotipo post tratamiento MO, (monitorear al paciente durante y después de la terapia) Protocolo (corte de tejido adecuado, respetar las temperaturas y una buena digestión con proteasa) Para mejorar la aplicación de la técnica FISH (desarrollar nuevas sondas) que detecten genes candidatos →desarrollo y progresión del tumor (otros tipos de tumores sólidos).

36 BIBLIOGRAFÍA INTRODUCCIÓN OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA AGRADECIMIENTOS

37 BIBLIOGRAFÍA ACS. (2012). American Cancer Society. Extraído el 3 de Marzo de 2012, desde Bown, N. (2001). Neuroblastoma Tumour Genetics: Clinical and Biological aspects. JClin Pathol, 54, González N., Leonel A., Aristizábal B., y Beatriz H. (2010). Evaluación de tres métodos moleculares para el rastreo e identificación de HER2/neu. Medicina UPB, 29,17-40. Haschek, W. (2009). Fundamentals of Toxicologic Pathology. Londres: Academic Press. Hurria, A. (2010). Practical Geriatric Oncology. USA: Cambridge University Press Iwamoto, Y. (2007). Diagnosis and Treatment of Ewing’s Sarcoma. Jpn J Clin Oncol, 37, 79–89. Khosravi, P., Pérez, G. (2006). Linfoma B difuso de células grandes. Med Clin , 127, Manzitti,J., Mansilla, M. (2010). Cuál es su diagnóstico? Descripción del caso presentado en número anterior: Retinoblastoma. Arch.Argent.Pediatr.,108 , NCI. (2010). Instituto Nacional del Cáncer. Extraído el 25 de Enero de 2012, desde Papaioannou, G., McHugh, K. (2005). Neuroblastoma in childhood:Review and Radiological findings. Cancer Imaging, 5,

38 AGRADECIMIENTOS INTRODUCCIÓN OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA AGRADECIMIENTOS

39 AGRADECIMIENTOS

40 “La confianza en uno mismo es el primer paso para el éxito"
Anónimo