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EXPRESIÓN EN TRIPANOSOMÁTIDOS Verónica Fernández Mancebo 2013 Trypanosoma brucei Trypanosoma cruci Leishmania major Leishmania mexicana.

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1 EXPRESIÓN EN TRIPANOSOMÁTIDOS Verónica Fernández Mancebo 2013 Trypanosoma brucei Trypanosoma cruci Leishmania major Leishmania mexicana

2 Trypanosoma brucei

3 Organización del genoma nuclear L. major: 32.8Mb en 36 cr peq. ( Mb) T. brucei: 26Mb en 11cr grandes T. cruci: 60.3Mb en 41 cr peq Organizado en grandes grupos de genes policistrónicos (PGCs) (10 a cientos de genes codifican proteínas en la misma hebra)

4 Repetidos Repetidos 3253 ¿Promotor? ¿Otras seq? Codif. para ARNt ó ARNr Organización policistrónica GGGTTA

5 ARN polimerasas nucleares SUBUNIDADES ARNpol ARNpol II 12, ARNpol I 14, ARNpol III 17 5 subun son compartidas entre las 3 2 subun son compartidas entre I y III con homólogas en la II 5 subun homólogas entre las 3 5 subun son específicas de III 2 subun son específicas de I Diferencias con eucariotas superiores: Existen varias copias para algunas de las subunidades El CTD de la pol II no contiene los repetidos 7-pept característicos de eucariotas superiores 3 ARN polimerasas nucleares (I, II y III) Transcripción policistrónica (genes no relacionados func.) Inicio de la transcripción

6 Se han identificado muy pocos Algunos muestran clara identidad de seq con los ortólogos en levaduras y vertebrados Otros presentan muy baja identidad Para ARN-pol II: TRF4 (ortólogo div de TFIIB); SNAPc (SNAP50+SNAP2+SNAP3); TFIIA; TFIIH (9 sub); complejo PBP2 Para ARN-pol III: TFIIIB (2 subunidades) Para ARN-pol I: CITFA (específico para tripanosomátidos) Factores de transcripción

7 Copyright © 2004, American Society for Microbiology Mol Cell Biol November; 24(21): 9610–9618. doi: /MCB Functional Characterization of a Trypanosoma brucei TATA-Binding Protein- Related Factor Points to a Universal Regulator of Transcription in Trypanosomes Jia-peng Ruan,1 George K. Arhin,2 Elisabetta Ullu,2,3 and Christian Tschudi1,2* Departments of Epidemiology and Public Health1 Internal Medicine2 Cell Biology, Yale University Medical School, New Haven, Connecticut3 *Corresponding author. Mailing address: Department of Epidemiology and Public Health, Yale University Medical School, 295 Congress Ave., New Haven, CT Phone: (203) Fax: (203) Received 2004 May 16; Revised 2004 July 19; Accepted 2004 August 13. TRF-4 y SNAP50 Rol esencial en ARN pol I, II y III No necesariamente se unen en la región promotora, pero son importante en la transcripción de los genes: PARP, SL, U-snRNA Factor universal de transcripción relacionado con TBP (TRF4: TBP related factor 4)

8 Finalización de la transcripción Para ARN-pol II: Tract de 6 o más T en 3 del SL (similar a pol III) está involucrado en la finalización de la transcripción, pero no en la transcripción de genes de proteínas (¿diferencia en los complejos que transcriben?) En PGCs convergentes se separan por varios ARNt ¿la transcripción termina dentro de los genes de ARNt? ¿estructura de la cromatina importa en la finalización de la transcripción? Para la ARN-pol III: Finaliza en varias Ts en el 3 (nº variable en cada ARNt). No se ha identificado alguna proteína involucrada Para la ARN-pol I: Finaliza en el 3, en área conteniendo secuencias cortas con potencial de formar un loop (similar a bacteria indep de rho) En genes de PRO: 3 elementos de secuencias en el 3 que actúan sinergisticamente en una manera dependiente de la orientación

9 Es responsable de la transcripción de genes estruct (act, tubulina), de los genes del miniexon (ARN-ME o SLRNA) y otros snoARNEs responsable de la transcripción de genes estruct (act, tubulina), de los genes del miniexon (ARN-ME o SLRNA) y otros snoARN No parece existir promotores clásicos de eucariotasNo parece existir promotores clásicos de eucariotas Expresión constitutiva sin gran regulación en el inicio de la transcripción (similar a los TATA-less de eucariotas superiores)Expresión constitutiva sin gran regulación en el inicio de la transcripción (similar a los TATA-less de eucariotas superiores) Sin intrones (excep Poli(A) polim. de T.brucei, T.cruzi)Sin intrones (excep Poli(A) polim. de T.brucei, T.cruzi) Transcripción policistrónica mRNA maduro monocistrónico: capping, poli(A)Transcripción policistrónica mRNA maduro monocistrónico: capping, poli(A) ARN polimerasa II

10 TripartitaInr 100pb Inr = CYAC/AYR(+1) SL-RNA T...T Pol II PBP2PBP1 3 subunidades una TBP-like Inr Inr Evidencia que recluta la pol II Promotor para ARN-pol II

11 Todos los genes de un PGC son transcriptos al mismo nivel como unidad policistrónicaTodos los genes de un PGC son transcriptos al mismo nivel como unidad policistrónica Todos los ARNm maduros comienzan con la misma secuencia de nt -> miniexon (ME - SL)Todos los ARNm maduros comienzan con la misma secuencia de nt -> miniexon (ME - SL) Esa secuencia no se encuentra en las vecindades del gen que está siendo analizadoEsa secuencia no se encuentra en las vecindades del gen que está siendo analizado Existen genes para ME por núcleo en tandemExisten genes para ME por núcleo en tandem c/u está presente en un repetido de aprox 1,3 kbc/u está presente en un repetido de aprox 1,3 kb Su transcripto presenta Cap 4 (m7G, metilaciones 2OH ribosas 1-4 y metilaciones en las bases 1 y 4) y es monocistrónicoSu transcripto presenta Cap 4 (m7G, metilaciones 2OH ribosas 1-4 y metilaciones en las bases 1 y 4) y es monocistrónico Qué se sabe sobre los pre-ARNm

12 trans-splicing y poliadenilación están acoplados Generan ARNm maduro para ser exportado del núcleo

13 ARNm de las sintetasas de aminoacil-tRNA

14 Si todos los genes del una PGC se transcribe en un mismo transcripto primario ¿por qué se tiene diferente concentración de las proteínas codificadas por esos genes? Incluso ¿diferente concentración de ARNm maduro?

15 Transcripción constitutiva de genes para proteínas La principal regulación se da a nivel POST-TRANSCRIPCIONAL Elongación Regiones intergénicas (ME/poli(A)) Estabilidad ARNm (3UTR) Traducción Estabilidad de la proteína Reg. Cod. ME AAAAA n 5 UTR 3 UTR Regulación de la expresión Esta regulación es la clave para los cambios en la expresión génica Elementos en las regiones intergénicas (rol de las regiones UTR)

16 GP82: gp de superficie presente en la forma infectiva y ausente en la sanguínea

17 Destinos de los ARNm en tripanosomátidos (modelo) ORF 3UTR 5UTR CAP4 RBP

18 Transcribe ARN pequeños (5S, tARNs, 7SL-ARN y todos snARN) usando snARN Básicamente presenta los mismos promotores que eucariotas superiores: estar tanto en la región 3 como 5 Promotor para ARN-pol III DSE PSE TATA DSE PSE TATA Tipo III AC Tipo I AB Tipo II Punto de inicio ARNr 5S ARNt U2-U6 TSS/Inr T. brucei

19 Transcribe: ARN ribosomal (nucleolo) y genes de Ags de superficie (VSG y PRO) ARNr maduro: 20% 5PO4 y 80% 5 OH Promotor parecido de los eucariotas superiores Core promoter Punto de inicio –170 –150 –130 –110 –60 –40 –20 – Upstream control element Pol I Promotor para ARN-pol I Dom III (distal) Dom II DomI

20 Core Promotor para ARN Pol I Suficiente para transcribir VSG Se estimula la actividad por la presencia de elementos en el 5 (UCE) Aparentemente están siempre activos (regulación de las unidades de VSG y de PRO?).

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22 VSGs T. brucei: Inmunofluorescencia de formas sanguíneas usando Acs contra VSG 221 VSG VO2 Variant Surface Glycoprotein

23 Cada cambio se acompaña de un pico de parasitemia 1.Southern blot: ADN de distintas poblaciones del parásito, Digestión con enzimas de restricción, Electroforesis en gel de agarosa, Transferencia a membrana de nylon, Hibridización. 2.Hirbridización con un ADNc de una población (pej. b) abcd...etc Copia Básica (BC) Copia ligada a la expresión (ECL) Más del 50% de los genes VSGs siguen este patrón Genes VSG: copia ligada a la expresión (ECL) VSG Cambio de Expresión

24 VSG(tel-inact) VSG(interno) VSG(tel-act) VSG(tel-inact) VSG(interno) VSG(tel-act) VSG(tel-inact) VSG(interno) VSG(tel-act) VSG(tel-inact) VSG(interno) VSG(copia-act) VSG(tel-act) VSG(tel-inact) VSG(interno) VSG(tel-act) VSG(interno) VSG(tel-inact) La formación del ELC ocurre por conversión génica

25 ARN pol mitocondrial (mitARNpol) El ADN en el kinetoplasto está distribuído en: maxi-(30-50kb) y mini-( kb) círculos copias copias genoma mitocondrial ARNguias No se han encontrado secuencias promotoras consenso Transcribe ARN poli-cistrónicos que luego se procesa (corte en ARN monocistrónicos seguido/acompañado de editado (+/-U), poli-A para ARNm y poli-U para ARNg) NOTA: en el núcleo se transcriben:.el ARN mitARNpol, que se sintetiza en el citosol (1 subunidad).los ARNt del kinetoplasto y se deben importar

26 RET1 (RNA editing TUTase 1).

27 Editado Modificación de información génica codificada en el ADN Se adicionan o se remueven bases del ARNm (en general se introducen o se sacan U) Ocurre en la mayor parte de los ARN mitocondrial. Se corrige el marco de lectura. Simple: número pequeño de U en el extremo 5´ cox2 T.brucei Extensa: 60% del ARNm maduro no codificado por el gen > 50% de los genes de T. brucei mitocondriales, ej. Cox3

28 Todos los ARNg tienen su propio gen en el minicírculos mitocondriales (salvo el 3 de COXII) Son pequeños (40-70nts) y no sufren edición. El extremo 5 de cada ARNg es complementario a la secuencia cercana a la región editada hacia el 3 del mRNA. El extremo 3 de los gRNAs tienen una cola de U (5-15nts), agregada por una terminal uridil transferasa (TUTasa). La región intermedia contiene la secuencia complementaria a la porción editada del mRNA. (AU, GC y GU) ARNg Editado anclas Seq guía de edición pre-ARNm ARNg Editosoma: corta el transcripto y agrega Us (TUTasa), mantiene los extremos abiertos, elimina las Us no apareadas (exoribonucleasa U- específica) y liga los extremos del transcripto mRNA editado.

29 (Blum et al. 1990

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31 TbRGG2

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34 Armar marcos de lectura: - crear codón de inicio y de terminación, - establecer marcos de lecturas funcionales La edición es esencial para la diferenciación en T. brucei Las cantidades relativas de ARNm editado y sin editar varía en los diferentes estadios (¿mec. de regulación?) Algunas consideraciones Editado

35 La edición alternativa del RNAm de la citocromo C oxidasa mitocondrial III (COXIII) en Trypanosoma brucei produce una nueva proteína de unión a ADN: AEP-1. AEP-1 sería una estructura que enlaza físicamente el kADN y cuerpos basales flagelares.

36 La expresión en tripanosmátidos… Entender la regulación la expresión génica ayudaría a comprender procesos (diferenciación, virulencia, variación antigénica) y a encontrar blancos claves para controlar la infección. Mecanismo de expresión único (transcrip policistrónica, trans- splicing, editado de ARNm, la ARNpol I sintetiza ARNm). La iniciación de la transcripción de genes de proteínas parece ser comparable a los promotores sin caja TATA de humanos y otros mamíferos (cr 1 de L major). La transcripción no parece ser atípica ya que se han identificado factores de transcripción generales diferentes a los eucariotas superiores.

37 ¿PREGUNTAS?


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