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TRANSCRIPCIÓN EN TRIPANOSOMÁTIDOS 2007. 4 ARN polimerasas (I, II y III; y mitocondrial)4 ARN polimerasas (I, II y III; y mitocondrial) Factor universal.

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1 TRANSCRIPCIÓN EN TRIPANOSOMÁTIDOS 2007

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3 4 ARN polimerasas (I, II y III; y mitocondrial)4 ARN polimerasas (I, II y III; y mitocondrial) Factor universal de transcripción relacionado con TBP (TRF4: TBP related factor 4)Factor universal de transcripción relacionado con TBP (TRF4: TBP related factor 4) Organización general de genes: policistrónica (no relacionados funcionalmente)Organización general de genes: policistrónica (no relacionados funcionalmente) Capping de ARNm (por trans-splicing)Capping de ARNm (por trans-splicing) La regulación post-transcripcional es la clave para los cambios en la expresión génicaLa regulación post-transcripcional es la clave para los cambios en la expresión génica Esta regulación se ejerce a través de elementos en las regiones intergénicas (rol de las regiones UTR)Esta regulación se ejerce a través de elementos en las regiones intergénicas (rol de las regiones UTR) Transcripción en Tripanosomátidos

4 Transcribe ARN pequeños (5S, tARNs y snARN) usando snARN Básicamente presenta los mismos promotores que eucariotas superiores: estar tanto en la región 3 como 5 ARN polimerasa III ? ? ? ? ? ? Tipo 3 AC Tipo 1 AB Tipo 2 Punto de inicio ARNr 5S ARNt U1-U5 (diferencia con eucariotas sup)

5 Transcribe ARN ribosomal (nucleolo) y además, transcribe 2 grupos de genes que incluye Ags de superficie (VSG y PRO)Transcribe ARN ribosomal (nucleolo) y además, transcribe 2 grupos de genes que incluye Ags de superficie (VSG y PRO) Los transcriptos ARNr no se le agrega cap: 20% 5 tri-PO4 y 80% 5 OHLos transcriptos ARNr no se le agrega cap: 20% 5 tri-PO4 y 80% 5 OH La estructura del promotor es semejante a los otros eucariotas: bipartitaLa estructura del promotor es semejante a los otros eucariotas: bipartita Core promoter Punto de inicio –170 –150 –130 –110 –60 –40 –20 – Upstream control element Pol I ARN polimerasa I

6 Core Promotores de ARN Pol I Similar a los promotores de ARNr euc. superiores Suficiente para transcribir VSG Se estimula la actividad por la presencia de elementos en el 5 (UCE) Aparentemente están siempre activos (la regulación para las unidades de VSG y de PRO es en la elongación).

7 Mitocondrial transcripción: ARN polimerasa mitocondrial (mitARNpol) Nota: El ADN en el kinetoplasto está distribuído en: maxi- y mini- círculos 30-50kb kb copias copias genoma mitocondrial ARNguias No se han encontrado secuencias promotoras consenso mitARNpol es transcripta en el núcleo como una única subunidad Nota: los ARNt del kinetoplasto se transcriben en el núcleo y se deben importar

8 Es responsable de la transcripción de genes estructurales (actina y tubulina), de los genes del miniexon (ARN-ME o SLRNA) y otros snARN Bajo nº de promotores y diferentes a otros eucariotas No hay gran regulación en el inicio de la transcripción Expresión constitutiva Sin intrones (excep Poli(A) polim. de T.brucei, T.cruzi) Transcripción policistrónica la finalización de la transcripción al final del policistrón no está caracterizada aún mRNA maduro monocistrónico: capping, poli(A) ARN polimerasa II (presenta dominio CTD)

9 SL-RNA T...T Pol II Promotores de ARN Pol II Como no existen evidencias de promotores clásicos de ARN pol II, se ha sugerido que inicia la transcripción al azar Se conoce: -Secuencias consenso en promotores para miniexon -Proteínas de unión a promotor del miniexon PBP2PBP1 3 subunidades una TBP-like Evidencia que recluta la pol II Los promotores se encuentran en el 5 de cada copia (bipartita) Finalización? (semejante a bacteria: rho- independiente)

10 Todos los ARNm estudiados comienzan con la misma secuencia de nt -> miniexon (ME - SL) Esa secuencia no se encuentra en las vecindades del gen que está siendo analizado Existen genes para ME por núcleo en tandem c/u está presente en un repetido de aprox 1,3 kb Su transcripto presenta Cap 4 (m7G, metilaciones 2OH ribosas 1-4 y metilaciones en las bases 1 y 4) y es monocistrónico Procesamiento del pre-ARNm / Trans-splicing

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12 ADN El trans-splicing es un mecanismo utilizado para generar ARNm maduro para ser exportado del núcleo

13 trans-splicing y poliadenilación están acoplados Trans-splicing alternativo: se describió para LYT una proteína de asociada con la virulencia. La diferncia son 28 aa en el N-t: La > es de membr (fase virulenta) la menor está en el kinetoplasto.

14 Transcripción de genes para proteínas es constitutiva No existen factores que regulen la iniciación de la transcripción Regulación se debe dar luego del inicio de la transcripción Elongación ME/poli(A) 3UTR traduccional estabilidad de la proteína

15 transcripto policistrónicoMaquinaria de procesamiento de ARNm ARN polimerasa encargada de la elongación Control sobre secuencias intergénicas Podría ser más eficiente si se cambia la elección de un gen en un ARN pre- existente que en el ADN ya que se debe reclutar reguladores específicos (aunque esto implique una gran degradación del transcriptoma)

16 3UTR de PRO: Estabilidad / Degradación ME AAAAA n 5 UTR 3 UTR ME AAAAA n AAAA ME ME AAAAA n AAAA ME Se cree que estos factores externos actúan sobre elementos en el 3UTR Factores que regulan la producción de ARNm de PRO también regulan opuestamente el sitio activo de transcripción de la VSG 27º citrato 37º no-citrato Transcripciónbasal

17 Editado Modificación de la información génica codificada en el ADN. Se adicionan o se remueven bases del ARNm. Generalmente se introducen o se sacan U Se corrige el marco de lectura Ocurre en la mayor parte de los ARN mitocondrial. Simple: número pequeño de U en el extremo 5´ cox2 en T.brucei Extensa: 60% del ARNm maduro no codificado por el gen > 50% de los genes de T. brucei mitocondriales, ej. Cox3

18 - En mitocondrias de Trypanosoma: la citocromo oxidasa subII (coxII) que tiene insertadas 4 U que cambian aminoácidos y además cambia el marco de lectura. Como no existe otro gen, las U fueron agregadas luego de la transcripción - Mecanismo: se encontraron ARN-guías, que contiene una secuencia complementaria del transcripto Acción de la TUTasa usando pool de UTP de la célula Endorribonucleasa y ligasa (ATP) Eucariotas inferiores:

19 Todos los gRNA tienen su propio gen en el minicírculos mitocondriales (salvo el 3 de COXII) Son pequeños (40-70nts) y no sufren edición. El extremo 5 de cada gRNA es complementario a la secuencia cercana a la región editada hacia el 3 del mRNA. El extremo 3 de los gRNAs tienen una cola de U (5-15nts), que es agregada por una terminal uridil transferasa (TUTasa). La secuencia intermedia contiene una secuencia que es complementaria a la porción editada del mRNA. (AU, GC y GU) CARACTERÍSTICAS DE LOS gARN

20 Armar marcos de lectura: - crear codón de inicio y de terminación, - establecer marcos de lecturas funcionales La edición es esencial para la diferenciación en T. brucei Las cantidades relativas de ARNm editado y sin editar varía en los diferentes estadios (mecanismo de regulación?) Algunas consideraciones del editado

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22 Variación antigénica T. brucei: Inmunofluorescencia de formas sanguíneas usando anticuerpos contra la VSG 221 (verde) o la VSG VO2 (rojo).

23 Glicoproteínas variables de superficie que constituyen una cubierta densa e inmunogénica de la membrana plasmática ( 10 7 por organismo) Son grandes kDa Sólo una se expresa por vez El cambio de expresión de VSG se realiza en forma espontánea (1 cada 100 por generación) Existen aproximadamente 1000 potenciales variantes por organismo Variant surface glycoprotein (VSG)

24 Los sitios de expresión están ligados a telómeros Existen aproximadamente 20 sitios de expresión El sitio activo de expresión aparentemente no se encuentra en un cuerpo nucleolar Sólo una se expresa, es decir que sólo se expresa la copia ELC que está localizada en el sitio de expresión que está bien cerca del telómero

25 Cada cambio se acompaña de un pico de parasitemia 1.Southern blot: ADN de distintas poblaciones del parásito, Digestión con enzimas de restricción, Electroforesis en gel de agarosa, Transferencia a membrana de nylon, Hibridización. 2.Hirbridización con un ADNc de una población (pej. b) abcd...etc Copia Básica (BC) Copia ligada a la expresión (ECL) Más del 50% de los genes VSGs siguen este patrón Genes VSG: copia ligada a la expresión (ECL)

26 Cada VSG es codificado por una copia básica que puede encontrarse a 5-15kb del telómero (teloméricos) o >50kb del telómero (internos) VSG(tel-inact) VSG(interno) VSG(tel-act) Expresión algo programada (aparentemente involucra a la cantidad de repetidos de 70pb)

27 VSG(tel-inact) VSG(interno) VSG(tel-act) VSG(tel-inact) VSG(interno) VSG(tel-act) VSG(tel-inact) VSG(interno) VSG(tel-act) VSG(tel-inact) VSG(interno) VSG(copia-act) VSG(tel-act) VSG(tel-inact) VSG(interno) VSG(tel-act) VSG(interno) VSG(tel-inact) La formación del ELC ocurre por conversión génica

28 Existen muchas copias del gen VSG en el genoma. La mayoría de los genes VSG son pseudogenes: recombinación puede generar nuevos genes VSG aumentando la variabilidad. Esta nueva información la guarda temporariamente cambiando el sitio de expresión Aparentemente el silenciamiento de los otros sitios de expresión y la recombinación son independientes

29 Otro ejemplo es la bacteria Borrelia hermsii que causa la fiebre recurren- te en el hombre. Esta bacteria sobrevive alterando una proteína de superficie (VMP), que están asociados con rearreglos en el genoma. El gen VMP activo está localizado cerca del telómero de un plásmido lineal. 3000pb Región transpuesta Repetidos cortos? 8kb 40kb 5 3 TELOMERO VSG 1500pb (CCCTAA)n


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