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El super-organismo humano Ecología Microbiana del Tracto Gastrointestinal (GI). 400-500 especies bacterianas habitan el tracto intestinal humano. El.

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2 El super-organismo humano

3 Ecología Microbiana del Tracto Gastrointestinal (GI) especies bacterianas habitan el tracto intestinal humano. El 99% de las bacterias totales pertenecen a especies. La mayor población se halla en el colon, con células bacterianas. (10 veces más que todas las células del cuerpo).

4 Patógenos intestinales Diarrea asociada a Clostridium difficile Gastritis y úlceras asociadas a Helicobacter pylori Enterocolitis asociada a Salmonella, Escherichia, Pasteurella. Diarreas asociadas a rotavirus. Colitis y mala absorción Giardia intestinalis (parásito intestinal).

5 ProbióticosPrebióticos Microorganismos que producen efectos benéficos en la salud del consumidor. (Bifidobacterias, Lactobacilos) Compuestos no digeribles que favorecen el desarrollo y establecimiento de la flora bacteriana benéfica en el colon. (galacto- oligosacáridos de leche materna, fructo- oligosacáridos de plantas, sorbitol, xilitol, isomaltosa) Simbióticos

6 Empleando leche hervida como medio de cultivo aisló un cultivo puro Bacterium lactis. (Lactobacillus, 1901) Lactobacillus Lister Joseph (1857)

7 Estudios originados por la longevidad de ciudadanos búlgaros. Primeros estudios científicos que respaldan los efectos benéficos en la salud por consumo de leche fermentada con Bulgarian bacillus (Lactobacillus bulgaricus). Producción de compuestos benéficos Exclusión de patógenos en la mucosa intestinal. Estimulación del sistema inmune Eliminación de productos tóxicos Elías Metchnikoff, 1907

8 Henry Tissier (1906) Bifidobacterium Observó abundantes bacterias Y en heces de niños saludables, y escasas en aquellas de niños con diarreas. ( Observó abundantes bacterias Y en heces de niños saludables, y escasas en aquellas de niños con diarreas. (Bacillus bifidus). Nueve de cada diez niños tratados con B bifidus se recuperaron rápidamente de la diarrea.

9 Microorganismos vivos que después de ser ingeridos en cantidades adecuadas, otorgan beneficios a la salud que superan las inherentes necesidades básicas nutricionales Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura. Organización Mundial de la Salud (FAO/WHO), 2001 Definición Lilly & Stilwell, 1965 Sustancias secretadas por un organismo y capaces deestimular el crecimiento de otro. Guarner & Shaafsma, 1998 Microorganismos vivos que cuando se consumen en cantidades adecuadas como parte de un alimento, confieren al huésped un beneficio para la salud.

10 Inocuidad (GRAS, QPS). Identificación taxonómica de la cepa probiótica Estabilidad genética Resistencia frente a antibióticos Condiciones a cumplir por los microorganismos probióticos Criterios de seguridad Kakisu E, 2010

11 Viabilidad en el producto Factibilidad de reproducción a mayor escala Resistencia a fagos Si forman parte de un alimento, estabilidad de propiedades probióticas durante vida útil del mismo Condiciones a cumplir por los microorganismos probióticos Criterios tecnológicos

12 Resistencia a condiciones del tracto GI Viabilidad y eventual proliferación en intestino Capacidad de adherirse y colonizar fácilmente el tracto gastrointestinal compitiendo con patógenos. Presentar actividad antagónica frente a patógenos in vitro e in vivo. Sinergismos de cepas probióticas Capacidad comprobable de otorgar beneficios al huésped Condiciones a cumplir por los microorganismos probióticos Criterios funcionales

13 Criterios de seguridad: Identificación de la cepa probiótica: Resolución taxonómica de las técnicas de uso más frecuente RFLP PFGE Ribotipificación AFLP, AP-PCR, rep-PCR, RAPD ARDRA Tipificación mediante bacteriocinas, fagotipificación Serotipificación Zimogramas Patrones electroforéticos de proteínas celulares totales Hibridaciones DNA-DNA % G+C Marcadores quimiotaxonómicos Fingerprinting de ácidos grasos celulares Estructura de pared celular Fenotipo Secuencia de rRNA Sondas de DNA Secuencias de DNA Familia Género Especie Cepa Modificado de Vandamme et al., 1996

14 Prevención y tratamiento de diarreas, úlceras y enfermedades inflamatorias crónicas de tracto GI Remodelación de las comunidades bacterianas gastrointestinales (Bifidobacterium spp, Lactobacillus reuteri) Modulación de la respuesta inmune Prevención y disminución de efectos pro-inflamatorios en alergias Profilaxis y tratamiento de enfermedades urogenitales Aumento de la digestibilidad de la lactosa por aporte de beta galactosidasa Efectos hipocolesterolemiantes ? Efectos terapéuticos en el tratamiento del cáncer ? Criterios funcionales: Efectos benéficos sobre la salud

15 Lutgendorff et al, 2010 La administración de probióticos reduce la apoptosis intestinal en pancreatitis aguda en ratas. Aumento del antioxidante glutatión (GSH) Probiótico multicepa: Lactobacillus acidophilus (W70), Lactobacillus casei (W56), Lactobacillus salivarius (W24), Lactococcus lactis (W58), Bifidobacterium bifidum (W23), and Bifidobacterium lactis (W52) (previously classifiedas Bifidobacterium infantis) (EcologicH 641, Winclove Bio Industries, Amsterdam, the Netherlands).

16 Efecto dosis-respuesta de diferentes cepas probióticas sobre perfiles lipídicos Ooi & Liong, 2010

17 Efecto dosis-respuesta de diferentes cepas probióticas sobre perfiles lipídicos: estudios en humanos Ooi & Liong, 2010 Existen algunos datos controversiales, atribuíbles a diferencias en las cepas empleadas, dosis y duración del tratamiento, grupos contol inadecuados, etc

18 Efectos inmunológicos Modulación de la respuesta inmune: aumento de IgA, activación células NK, incremento de la actividad fagocítica, proliferación de linfocitos B, producción de citoquinas (IL2, IL6, IL10) o factor de necrosis tumoral (TNF) (Takeda et al, 2006; Sheih et al, 2001; Kitazawa et al, 2001; Galdeano y Perdigón, 2006; Humen et al, 2005)

19 Materia fecal Sangre Intestino IgA especifica. Antígenos específicos de Giardia IgG esp. Recuento de Trofozoitos Enzimas HistologíaMuestras: Giardia intestinalis Cepa WB clon C6 (5x10 5 por animal) Estudio de la cinética de infección en merión. Administración de Lactobacillus johnsonii LA1 (10 8 UFC/animal/día) Sacrificio y muestreo Día Grupo Tratamiento: Grupo Placebo: Agua mineral (Humen et al, 2005) Efectos inmunológicos

20 Cinética de infección: La1 Placebo En el grupo placebo hay un pico de infección al día 7 (p=0.05) Days post-inoculation Day 7 Day 14 Day 21 La1PlaceboLa1PlaceboLa1Placebo Infecction rate 3/1110/120/126/140/63/6 Fisher test (p) Determinación de antígenos específicos de giardia (GSA-65) en materia fecal La1 Placebo En el grupo Placebo se encontró un aumento en la liberación de antígenos (GSA-65) dependiente del tiempo. El grupo tratamiento mostró una menor liberación de antígeno. Efectos inmunológicos Humen et al, 2005

21 Posibles Mecanismos Probióticos Actividad anti microbiana/Interferencia con patógenos. Regulación de la digestión y eliminación de sustancias nocivas. Efectos inmunológicos.

22 Ácidos: acético, láctico, propiónico: > pH e inactivan crecimiento bacteriano (E coli, Salmonella, etc.) H 2 O 2, forma radicales libres atacan membrana lipídica. (Candida, Gardenella). Bacteriocinas: péptidos anti microbianos. Interaccionan con receptores de la bacteria blanco- produciendo cambios a nivel de membrana que conducen a la muerte bacteriana. (Nisina) Competencia por sustratos. Competencia por sitios de unión al epitelio, efectos estéricos. Actividad anti microbiana/competencia

23 Regulación de la digestión y eliminación de sustancias nocivas Mejora la absorción de nutrientes. Elimina sustancias tóxicas (derivados fenólicos de metabolismos de aminoácidos, etc., efectos anti carcinogénicos y anti tumorales). Facilitan la hidrólisis de lípidos y proteínas liberando aminoácidos y ácidos grasos fácil de absorber. Aporte de enzimas que ayudan degradar sustancias. Ej. Intolerancia a la latosa (β- galactosidasa). Aporte de vitaminas.

24 Identificación Cepa Genotípica y Fenotípicamente. (Hibridación, PCR, PFEG) Características Funcionales Tests in vitro Ensayos en Animales Aseguramiento de la inocuidad (GRAS) In vitro y/o animal Fase 1 estudio en humanos (voluntarios sanos) Sin actividad hemolítica ni producción de toxinas, no presentar resistencia a antibióticos, etc. Ensayos en humanos doble ciego controlado con placebo (Fase2, grupo con patología). Diseño apropiado de experimento. Resultados preliminares Fase 3. Ensayos efectividad al compararlos con tratamiento estándar de una condición específica. Rotulado: Contenido: Cepa, especie etc Mínimo Nº de bacterias viables del contenido Condiciones apropiadas de almacenaje Recomendado un 2º ensayo independiente para confirmar resultados. Probiótico Food and Agriculture Organization of the United Nations World Health Organization. FAO/WHO Pautas para el desarrollo de un Probiótico

25 Bacterias del ácido láctico Gram positivas No esporulantes Cocos o bacilos no respiradores Catalasa negativos Productoras de ácido láctico (Hagen et al., 2005) Estructura Metabolismo Aplicaciones biotecnológicas

26 Composición Proteína láctea (% w/w) a Mín 2,7% Grasa láctea (% w/w)Menos del 10% Acidez valorable, expresada como % de ácido láctico (% w/w) Mín. 0,6% Suma de microorganismos que constituyen el cultivo (ufc/g, en total) Mín Levaduras (ufc/g)Mín EtanolNo establecido Alimento obtenido por incubación de leche con gránulos de kefir. Los gránulos, compuestos por una matriz de proteínas y polisacáridos, contienen lactobacilos, lactococos, bacterias del ácido acético y levaduras, responsables de la fermentación. El kefir

27 Lactobacillus L. kefiranofaciens, L. acidophilus, L. alimentarius, L. casei, L. rhamnosus. Heterofermentadores: ácido acético L. brevis, L. buchneri, L. kefir, L. fermentum, L. fructivorans. Homofermentadores: Glucosa ácido láctico etanol Glucosa ácido láctico QPS ( Qualified Presumption of Safe, UE ) GRAS ( Generally Recognised As Safe, USA )

28 in suspension at liquid-surface interfaces on lipid films on liposomes on solid supports Subunits are held together and attached to the underlying cell surface by noncovalent interactions. Monomers have self-assembly ability to form regular layers Interactions can be disrupted in a reversible way by cation substitution or high concentration of chaotropic agents S-layer proteins: General aspects

29 Relatively small size 25 kDa to 71 kDa. Basic proteins with high pI between 9,0 y 10,4. Low content of cysteine and methionine High content of hydrophobic and hydroxyl amino acids. No SLH motifs have been detected but the attachment of the S-layer protein to the cell wall seems to involve also secondary cell wall polymers (SCWP). Presence of S-layer proteins are strain dependent Adhesive properties were demonstrated in several lactobacilli S-layers S-layer proteins of lactobacilli: General features

30 Proposed or identified adhesive surface proteins of Lactobacillus S-layer protein TargetSpecies / StrainReference S-layer proteinAvian intestinal epithelial cells Lactobacillus acidophilus spp. Schneitz et al., 1993 CbSACollagens, laminin Lactobacilluscrispatus JCM 5810 Toba et al., 1995 SlpAFibronectin, human epithelial cell line Lactobacillus brevis ATCC 8287 Hynönen et al., 2002 S-layer proteinRed blood cells Lactobacillus kefir CIDCA 8321 Garrote et al., 2004 Red blood cells Lactobacillus parakefir CIDCA 8328 Garrote et al., 2004 SlpAMurine ileal epithelial cells Lactobacillus acidophilus M92 Frece et al., 2005 S-layer proteinhuman epithelial cells Lactobacillus helveticus R0052 Johnson-Henry et al., 2007 S-layer proteinMammalian epithelial cell Lactobacillus amylovorus spp. Jakava-Viljanen et al., 2007 S-layer protein Sacharomyces lipolytica Lactobacillus kefir CIDCA 8315 Golowczyc et al., 2009 S-layer proteins of lactobacilli: Adhesive properties

31 Interacción entre L. kefir y S. lipolytica aisladas de gránulos de kefir Golowczyc et al, 2009 Actividad tipo lectina de la capa S (inhibición de la coagregación con levaduras en presencia de periodato o azúcares) Inhibición de la hemaglutinación por pérdida de capa S

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33 Distribución diferencial de bacterias en el colon Adaptado de Swidsinki et al FISH

34 Sykora J, Valeckova K, Amlerova J, Siala K, Dedek P, Watkins S, et al. Effects of a specially designed fermented milk product containing probiotic Lactobacillus casei DN and the eradication of H. pylori in children: a prospective randomized double-blind study. J Clin Gastroenterol 2005;39:692. Ooi & Liong. Cholesterol-Lowering Effects of Probiotics and Prebiotics: A Review of in Vivo and in Vitro Findings. Int. J. Mol. Sci. 2010, 11, Martín A. Humen,Graciela L. De Antoni, Jalil Benyacoub, María E. Costas, Marta I. Cardozo, Leonora Kozubsky, Kim-Yen Saudan, Angele Boenzli-Bruand, Stephanie Blum, Eduardo J. Schiffrin, and Pablo F. Pérez 1,2* Lactobacillus johnsonii La1 Antagonizes Giardia intestinalis In Vivo. Infect Immun (2): 1265–1269.


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