Alimentos probióticos

Presentación del tema: "Alimentos probióticos"— Transcripción de la presentación:

1 Alimentos probióticos

2 El super-organismo humano
Adapted from Glausiusz, Discover Magazine, June 2007, as well as images courtesy of the National Institutes of Health, National Cancer Institute, Centers for Disease Control, and Wikipedia. This figure depicts different microbes and other organisms that have been intimately associated with humans as commensals or potential pathogens. The numbers correspond to images of organisms and approximate anatomic locations where these organisms may reside on the human body. 1. Trichophyton and Epidermophyton are filamentous, parasitic microbes that cause athlete’s foot. 2. Vaginal microbiota, mostly Lactobacillus species secrete lactic acid and other antimicrobial compounds that prevent pathogen overgrowth. 3. More than 500 species of bacteria, weighing approximately 3.3 pounds in the average human adult, live inside the gastrointestinal tract. 4. More than 100 strains of human papillomavirus (HPV) can infect humans, causing a variety of warts from the common wart to plantar and flat warts. 5. Pediculus humanus capitis, the head louse, may have co-evolved with recent H. sapiens. 6. Oral Streptococcus species form biofilms that may be 300–500 cells in thickness on the surfaces of unbrushed teeth. 7. Demodex mites inhabit the follicles of the eyelashes and infest about 20 percent of people under the age of After initial infection with the varicella-zoster virus (chickenpox), the virus remains dormant in nerve ganglia and may cause disease due to re-activation later in life. 9. Approximately 1/12 of the human genome consists of DNA from fossil viruses that infected human ancestors millions of years ago. 10. Prevalent bacterial genera on the human skin include Streptococcus, Staphylococcus, and Corynebacterium.

3 Ecología Microbiana del Tracto Gastrointestinal (GI).
especies bacterianas habitan el tracto intestinal humano. El 99% de las bacterias totales pertenecen a especies. La mayor población se halla en el colon, con 1014 células bacterianas. (10 veces más que todas las células del cuerpo).

4 Patógenos intestinales
Diarrea asociada a Clostridium difficile Gastritis y úlceras asociadas a Helicobacter pylori Enterocolitis asociada a Salmonella, Escherichia, Pasteurella. Diarreas asociadas a rotavirus. Colitis y mala absorción Giardia intestinalis (parásito intestinal).

5 Probióticos Prebióticos Simbióticos
Microorganismos que producen efectos benéficos en la salud del consumidor. (Bifidobacterias, Lactobacilos) Compuestos no digeribles que favorecen el desarrollo y establecimiento de la flora bacteriana benéfica en el colon. (galacto-oligosacáridos de leche materna, fructo-oligosacáridos de plantas, sorbitol, xilitol, isomaltosa) Simbióticos

6 Lister Joseph (1857) Empleando leche hervida como medio de cultivo aisló un cultivo puro “Bacterium lactis”. (Lactobacillus, 1901) Lactobacillus

7 Elías Metchnikoff, 1907 Producción de compuestos benéficos
Estudios originados por la longevidad de ciudadanos búlgaros. Primeros estudios científicos que respaldan los efectos benéficos en la salud por consumo de leche fermentada con “Bulgarian bacillus” (Lactobacillus bulgaricus). Producción de compuestos benéficos Exclusión de patógenos en la mucosa intestinal. Estimulación del sistema inmune Eliminación de productos tóxicos

8 Henry Tissier (1906) Observó abundantes bacterias “Y” en heces de niños saludables, y escasas en aquellas de niños con diarreas. (Bacillus bifidus). Nueve de cada diez niños tratados con B bifidus se recuperaron rápidamente de la diarrea. Bifidobacterium

9 Definición Lilly & Stilwell, 1965 Sustancias secretadas por un organismo y capaces deestimular el crecimiento de otro. Guarner & Shaafsma, 1998 Microorganismos vivos que después de ser ingeridos en cantidades adecuadas, otorgan beneficios a la salud que superan las inherentes necesidades básicas nutricionales Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura. Organización Mundial de la Salud (FAO/WHO), 2001 Microorganismos vivos que cuando se consumen en cantidades adecuadas como parte de un alimento, confieren al huésped un beneficio para la salud.

10 Criterios de seguridad
Condiciones a cumplir por los microorganismos probióticos Criterios de seguridad Inocuidad (GRAS, QPS). Identificación taxonómica de la cepa probiótica Estabilidad genética Resistencia frente a antibióticos Kakisu E, 2010

11 Criterios tecnológicos
Condiciones a cumplir por los microorganismos probióticos Criterios tecnológicos Viabilidad en el producto Factibilidad de reproducción a mayor escala Resistencia a fagos Si forman parte de un alimento, estabilidad de propiedades probióticas durante vida útil del mismo

12 Criterios funcionales
Condiciones a cumplir por los microorganismos probióticos Criterios funcionales Resistencia a condiciones del tracto GI Viabilidad y eventual proliferación en intestino Capacidad de adherirse y colonizar fácilmente el tracto gastrointestinal compitiendo con patógenos. Presentar actividad antagónica frente a patógenos in vitro e in vivo. Sinergismos de cepas probióticas Capacidad comprobable de otorgar beneficios al huésped

13 Criterios de seguridad: Identificación de la cepa probiótica:
Resolución taxonómica de las técnicas de uso más frecuente Especie Familia Género Cepa RFLP PFGE Ribotipificación AFLP, AP-PCR, rep-PCR, RAPD ARDRA Tipificación mediante bacteriocinas, fagotipificación Serotipificación Zimogramas Patrones electroforéticos de proteínas celulares totales Hibridaciones DNA-DNA % G+C Marcadores quimiotaxonómicos Fingerprinting de ácidos grasos celulares Estructura de pared celular Fenotipo Secuencia de rRNA Sondas de DNA Secuencias de DNA Modificado de Vandamme et al., 1996

14 Criterios funcionales: Efectos benéficos sobre la salud
Prevención y tratamiento de diarreas, úlceras y enfermedades inflamatorias crónicas de tracto GI Remodelación de las comunidades bacterianas gastrointestinales (Bifidobacterium spp, Lactobacillus reuteri) Modulación de la respuesta inmune Prevención y disminución de efectos pro-inflamatorios en alergias Profilaxis y tratamiento de enfermedades urogenitales Aumento de la digestibilidad de la lactosa por aporte de beta galactosidasa Efectos hipocolesterolemiantes ? Efectos terapéuticos en el tratamiento del cáncer ?

15 Criterios funcionales: Efectos benéficos sobre la salud
Lutgendorff et al, 2010 La administración de probióticos reduce la apoptosis intestinal en pancreatitis aguda en ratas. Aumento del antioxidante glutatión (GSH) Probiótico multicepa: Lactobacillus acidophilus (W70), Lactobacillus casei (W56), Lactobacillus salivarius (W24), Lactococcus lactis (W58), Bifidobacterium bifidum (W23), and Bifidobacterium lactis (W52) (previously classifiedas Bifidobacterium infantis) (EcologicH 641, Winclove Bio Industries, Amsterdam, the Netherlands).

16 Efecto dosis-respuesta de diferentes cepas probióticas sobre perfiles lipídicos
Ooi & Liong, 2010

17 Efecto dosis-respuesta de diferentes cepas probióticas sobre perfiles lipídicos: estudios en humanos
Existen algunos datos controversiales, atribuíbles a diferencias en las cepas empleadas, dosis y duración del tratamiento, grupos contol inadecuados, etc Ooi & Liong, 2010

18 Efectos inmunológicos
Modulación de la respuesta inmune: aumento de IgA, activación células NK, incremento de la actividad fagocítica, proliferación de linfocitos B, producción de citoquinas (IL2, IL6, IL10) o factor de necrosis tumoral (TNF) (Takeda et al, 2006; Sheih et al, 2001; Kitazawa et al, 2001; Galdeano y Perdigón, 2006; Humen et al, 2005)

19 Efectos inmunológicos
Estudio de la cinética de infección en merión. Materia fecal Sangre Intestino IgA especifica. Antígenos específicos de Giardia IgG esp. Recuento de Trofozoitos Enzimas Histología Muestras: Giardia intestinalis Cepa WB clon C6 (5x105 por animal) Administración de Lactobacillus johnsonii LA1 (108 UFC/animal/día) Sacrificio y muestreo Día Grupo Tratamiento: Grupo Placebo: Agua mineral (Humen et al, 2005)

20 Days post-inoculation
Efectos inmunológicos Cinética de infección: La1 Placebo Days post-inoculation Day 7 Day 14 Day 21 La1 Placebo Infecction rate 3/11 10/12 0/12 6/14 0/6 3/6 Fisher test (p) 0.01 0.02 0.09 En el grupo placebo hay un pico de infección al día 7 (p=0.05) Determinación de antígenos específicos de giardia (GSA-65) en materia fecal La1 Placebo En el grupo Placebo se encontró un aumento en la liberación de antígenos (GSA-65) dependiente del tiempo. El grupo tratamiento mostró una menor liberación de antígeno. Humen et al, 2005

21 Posibles Mecanismos Probióticos
Actividad anti microbiana/Interferencia con patógenos. Regulación de la digestión y eliminación de sustancias nocivas. Efectos inmunológicos.

22 Actividad anti microbiana/competencia
Ácidos: acético, láctico, propiónico: > pH e inactivan crecimiento bacteriano (E coli, Salmonella, etc.) H2O2, forma radicales libres atacan membrana lipídica. (Candida, Gardenella). Bacteriocinas: péptidos anti microbianos. Interaccionan con receptores de la bacteria blanco-produciendo cambios a nivel de membrana que conducen a la muerte bacteriana. (Nisina) Competencia por sustratos. Competencia por sitios de unión al epitelio, efectos estéricos.

23 Regulación de la digestión y eliminación de sustancias nocivas
Mejora la absorción de nutrientes. Elimina sustancias tóxicas (derivados fenólicos de metabolismos de aminoácidos, etc., efectos anti carcinogénicos y anti tumorales). Facilitan la hidrólisis de lípidos y proteínas liberando aminoácidos y ácidos grasos fácil de absorber. Aporte de enzimas que ayudan degradar sustancias. Ej. Intolerancia a la latosa (β-galactosidasa). Aporte de vitaminas.

24 Probiótico Food and Agriculture Organization
Pautas para el desarrollo de un Probiótico Food and Agriculture Organization of the United Nations World Health Organization. FAO/WHO Identificación Cepa Genotípica y Fenotípicamente. (Hibridación, PCR, PFEG) Características Funcionales Tests in vitro Ensayos en Animales Aseguramiento de la inocuidad (GRAS) In vitro y/o animal Fase 1 estudio en humanos (voluntarios sanos) Sin actividad hemolítica ni producción de toxinas, no presentar resistencia a antibióticos, etc. Recomendado un 2º ensayo independiente para confirmar resultados. Ensayos en humanos doble ciego controlado con placebo (Fase2, grupo con patología). Diseño apropiado de experimento. Resultados preliminares Probiótico Fase 3. Ensayos efectividad al compararlos con tratamiento estándar de una condición específica. Rotulado: Contenido: Cepa , especie etc Mínimo Nº de bacterias viables del contenido Condiciones apropiadas de almacenaje

25 Bacterias del ácido láctico
Gram positivas No esporulantes Cocos o bacilos no respiradores Catalasa negativos Productoras de ácido láctico Estructura Metabolismo Aplicaciones biotecnológicas (Hagen et al., 2005)

26 El kefir Alimento obtenido por incubación de leche con gránulos de kefir. Los gránulos, compuestos por una matriz de proteínas y polisacáridos, contienen lactobacilos, lactococos, bacterias del ácido acético y levaduras, responsables de la fermentación. Composición Proteína láctea (% w/w)a Mín 2,7% Grasa láctea (% w/w) Menos del 10% Acidez valorable, expresada como % de ácido láctico (% w/w) Mín. 0,6% Suma de microorganismos que constituyen el cultivo (ufc/g, en total) Mín. 107 Levaduras (ufc/g) Mín. 104 Etanol No establecido Es uno de los derivados lácteos fermentados de consumo más antiguo, originario de las montañas del Cáucaso. Se cree que la palabra kefir deriva del vocablo turco keif, que significa buen sentimiento, debido a la sensación de bienestar que produce su ingestión. La composición del kefir y sus características organolépticas están sujetas a variaciones regionales. Dependen de factores como el tipo de leche utilizada y su contenido graso, la composición de los gránulos utilizados como starter y las condiciones del proceso. Es un producto de consistencia cremosa, efervescente (CO2), que contiene ácido acético, etanol, vitaminas del complejo B y compuestos aromáticos como diacetilo y acetaldehído. Los gránulos de kefir están constituidos por levaduras fermentadoras de lactosa (Kluyveromyces marxianus), levaduras no fermentadoras de lactosa (Saccharomyces omnisporus, S. cereviseae y S. exiguus), distintas especies de Lactobacillus, Bifidobacterium spp. y Streptococcus salivarius subsp. termophilus. Son masas gelatinosas, de color blanco o blanco-amarillento, similares a las flores del coliflor. Cada gránulo es un acúmulo de microorganismos inmersos en una matriz de polisacáridos (kefirano) y proteínas. Es un sistema ecológico complejo en el cual existe una relación simbiótica entre bacterias y levaduras. Se desconocen los mecanismos que determinan la formación de los gránulos de kefir y los intentos por obtenerlos a partir de cultivos puros han resultado infructuosos. La composición microbiológica es controversial y diferentes trabajos indican que la microflora es variable y depende del origen de los gránulos, las condiciones de cultivo y de almacenamiento y el proceso de elaboración En Argentina el kefir se produce en forma artesanal; la fabricación industrial de esta leche fermentada requiere el desarrollo de cultivos que funcionen como starters. Para ello resulta indispensable la caracterización microbiológica, el conocimiento de las propiedades tecnológicas y la tipificación genética de las cepas constituyentes de los gránulos así como el conocimiento de las características bioquímicas y metabólicas y las propiedades probióticas de las mismas. Se analizaron 4 gránulos de origen argentino y de distintas fuentes (CIDCA AGK1, AGK2, AGK3 y AGK4). Para cada uno de ellos se estudió:composición química y microbiológica, condiciones óptimas de conservación, características tecnológicas de la leche fermentada,propiedades prebióticas, (G.Garrote, Tesis Doctoral, 2001)

27 Lactobacillus QPS (Qualified Presumption of Safe, UE)
GRAS (Generally Recognised As Safe, USA) Homofermentadores: L. kefiranofaciens, L. acidophilus, L. alimentarius, L. casei, L. rhamnosus. Glucosa ácido láctico Heterofermentadores: L. brevis, L. buchneri, L. kefir, L. fermentum, L. fructivorans. Glucosa ácido láctico etanol ácido acético

28 S-layer proteins: General aspects
Subunits are held together and attached to the underlying cell surface by noncovalent interactions. Monomers have self-assembly ability to form regular layers Interactions can be disrupted in a reversible way by cation substitution or high concentration of chaotropic agents in suspension at liquid-surface interfaces on lipid films on liposomes on solid supports

29 S-layer proteins of lactobacilli: General features
Relatively small size 25 kDa to 71 kDa. Basic proteins with high pI between 9,0 y 10,4. Low content of cysteine and methionine High content of hydrophobic and hydroxyl amino acids. No SLH motifs have been detected but the attachment of the S-layer protein to the cell wall seems to involve also secondary cell wall polymers (SCWP). Presence of S-layer proteins are strain dependent Adhesive properties were demonstrated in several lactobacilli S-layers

30 S-layer proteins of lactobacilli: Adhesive properties
Proposed or identified adhesive surface proteins of Lactobacillus S-layer protein Target Species / Strain Reference S-layer protein Avian intestinal epithelial cells Lactobacillus acidophilus spp. Schneitz et al., 1993 CbSA Collagens, laminin Lactobacilluscrispatus JCM 5810 Toba et al., 1995 SlpA Fibronectin, human epithelial cell line Lactobacillus brevis ATCC 8287 Hynönen et al., 2002 Red blood cells Lactobacillus kefir CIDCA 8321 Garrote et al., 2004 Lactobacillus parakefir CIDCA 8328 Murine ileal epithelial cells Lactobacillus acidophilus M92 Frece et al., 2005 human epithelial cells Lactobacillus helveticus R0052 Johnson-Henry et al., 2007 Mammalian epithelial cell Lactobacillus amylovorus spp. Jakava-Viljanen et al., 2007 Sacharomyces lipolytica Lactobacillus kefir CIDCA 8315 Golowczyc et al., 2009 30

31 Interacción entre L. kefir y S
Interacción entre L. kefir y S. lipolytica aisladas de gránulos de kefir Actividad tipo lectina de la capa S (inhibición de la coagregación con levaduras en presencia de periodato o azúcares) Inhibición de la hemaglutinación por pérdida de capa S Golowczyc et al, 2009

32

33 Distribución diferencial de bacterias en el colon
FISH Adaptado de Swidsinki et al. 2009

34 Sykora J, Valeckova K, Amlerova J, Siala K, Dedek P, Watkins S, et al
Sykora J, Valeckova K, Amlerova J, Siala K, Dedek P, Watkins S, et al. Effects of a specially designed fermented milk product containing probiotic Lactobacillus casei DN and the eradication of H. pylori in children: a prospective randomized double-blind study. J Clin Gastroenterol 2005;39:692. Ooi & Liong. Cholesterol-Lowering Effects of Probiotics and Prebiotics: A Review of in Vivo and in Vitro Findings. Int. J. Mol. Sci. 2010, 11, Martín A. Humen,Graciela L. De Antoni, Jalil Benyacoub, María E. Costas, Marta I. Cardozo, Leonora Kozubsky, Kim-Yen Saudan, Angele Boenzli-Bruand, Stephanie Blum , Eduardo J. Schiffrin, and Pablo F. Pérez1,2*Lactobacillus johnsonii La1 Antagonizes Giardia intestinalis In Vivo. Infect Immun (2): 1265–1269.