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Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina Departamento de Patología Interpretación de patrones de Restricción del DNA producidos por PFGE:

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Presentación del tema: "Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina Departamento de Patología Interpretación de patrones de Restricción del DNA producidos por PFGE:"— Transcripción de la presentación:

1 Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina Departamento de Patología Interpretación de patrones de Restricción del DNA producidos por PFGE: Criterios para la tipificación de Cepas Bacterianas.

2 HERBERT PUENTES PUENTES Residente I Patología Universidad Nacional de Colombia

3 GENERALIDADES - PFEG Esta técnica separa moléculas de DNA en matrices de agarosa, sometiéndolas en campos eléctricos que se alternan en dos direcciones. Esta técnica separa moléculas de DNA en matrices de agarosa, sometiéndolas en campos eléctricos que se alternan en dos direcciones. Se considera el Gold standard de los métodos de tipificación molecular de cepas bacterianas. Se considera el Gold standard de los métodos de tipificación molecular de cepas bacterianas. Permite separar moléculas desde 20 Kpbs hasta 10 Mpbs. Permite separar moléculas desde 20 Kpbs hasta 10 Mpbs.

4 GENERALIDADES - PFEG Los aislamientos bacterianos crecen en un medio de cultivo habitual, y luego se combinan en agarosa fundida colocándose en pequeños moldes. Los aislamientos bacterianos crecen en un medio de cultivo habitual, y luego se combinan en agarosa fundida colocándose en pequeños moldes. Obteniéndose insertos de agarosa plugs que contienen las bacterias completas. Obteniéndose insertos de agarosa plugs que contienen las bacterias completas.

5 GENERALIDADES - PFEG Estas se someten a lisis in situ obteniendose DNA libre que permanece inmovilizado en la matriz de agarosa. Estas se someten a lisis in situ obteniendose DNA libre que permanece inmovilizado en la matriz de agarosa. Este DNA se corta con una enzima de restricción que tenga una frecuencia baja de corte según el genoma estudiado. Este DNA se corta con una enzima de restricción que tenga una frecuencia baja de corte según el genoma estudiado.

6 HISTORIA - PFEG Bruno Zimm et al. 70s demostraron que:. Después de remover un campo eléctrico, la molécula elongada de DNA se relajaba nuevamente a su estado no perturbado, y que la velocidad de relajación dependía de la longitud del DNA Bruno Zimm et al. 70s demostraron que:. Después de remover un campo eléctrico, la molécula elongada de DNA se relajaba nuevamente a su estado no perturbado, y que la velocidad de relajación dependía de la longitud del DNA

7 HISTORIA - PFEG David Schwartz, teorizó que: Esta propiedad de relajación del DNA podría ser usada para separar moléculas grandes de DNA, ya que al cambiar periódicamente la orientación del campo eléctrico, se podría forzar a estas moléculas a relajarse en el gel durante la remoción del 1º campo y a elongarse para alinearse con el nuevo campo. David Schwartz, teorizó que: Esta propiedad de relajación del DNA podría ser usada para separar moléculas grandes de DNA, ya que al cambiar periódicamente la orientación del campo eléctrico, se podría forzar a estas moléculas a relajarse en el gel durante la remoción del 1º campo y a elongarse para alinearse con el nuevo campo.

8 HISTORIA - PFGE David Schwartz, demostró la efectividad de su método de alternancia de campo, al separar cromosomas de levadura de cientos de pares de bases de longitud. David Schwartz, demostró la efectividad de su método de alternancia de campo, al separar cromosomas de levadura de cientos de pares de bases de longitud.

9 FUNDAMENTO - PFGE Cuando el primer campo eléctrico se aplica al gel las moléculas se alargan en dirección al campo y migran en el gel. Cuando el primer campo eléctrico se aplica al gel las moléculas se alargan en dirección al campo y migran en el gel.

10 FUNDAMENTO - PFGE Luego el primer campo eléctrico se suprime y un segundo campo formando algún ángulo con el primero, se activa. Luego el primer campo eléctrico se suprime y un segundo campo formando algún ángulo con el primero, se activa. Entonces el DNA debe cambiar su conformación y reorientarse antes de que pueda migrar en la dirección del 2º campo eléctrico. Entonces el DNA debe cambiar su conformación y reorientarse antes de que pueda migrar en la dirección del 2º campo eléctrico.

11 FUNDAMENTO - PFGE El tiempo requerido para esta reorientación tiene mucho que ver con el tamaño de la molécula. El tiempo requerido para esta reorientación tiene mucho que ver con el tamaño de la molécula. Moléculas más grandes tardan más tiempo en realinearse. Moléculas más grandes tardan más tiempo en realinearse. El tiempo en que tarda activo cada campo se denomina pulso y su duración depende del tamaño de las moléculas que se quieran separar. El tiempo en que tarda activo cada campo se denomina pulso y su duración depende del tamaño de las moléculas que se quieran separar.

12 EQUIPO PARA PFGE

13 TIPOS DE SISTEMAS DE PFGE Dependiendo de la geometría del electrodo, la homogeneidad y el método de reorientación de los campos eléctricos existen varios sistemas de PFGE. Dependiendo de la geometría del electrodo, la homogeneidad y el método de reorientación de los campos eléctricos existen varios sistemas de PFGE.

14 TIPOS DE SISTEMAS DE PFGE Los diferentes sistemas descansan sobre el mismo principio, someter a las moléculas de DNA a por lo menos dos campos eléctricos que se alternan. Los diferentes sistemas descansan sobre el mismo principio, someter a las moléculas de DNA a por lo menos dos campos eléctricos que se alternan. El tamaño limite máximo que puede ser resuelto por estos sistemas parece ser el mismo. El tamaño limite máximo que puede ser resuelto por estos sistemas parece ser el mismo.

15 SISTEMAS DE PFGE

16 TIPOS DE SISTEMAS DE PFGE Las principales diferencias entre los sistemas son: - Capacidad de obtener líneas rectas. - La velocidad de separación. - La resolución dentro de un rango particular de tamaños. - El tamaño de la porción del gel que provee separación útil. Las principales diferencias entre los sistemas son: - Capacidad de obtener líneas rectas. - La velocidad de separación. - La resolución dentro de un rango particular de tamaños. - El tamaño de la porción del gel que provee separación útil.

17 TIPOS DE SISTEMAS DE PFGE Aunque muchos tipos de instrumentación para PFEG están disponibles en la actualidad, estos generalmente caen en dos categorías básicas. Aunque muchos tipos de instrumentación para PFEG están disponibles en la actualidad, estos generalmente caen en dos categorías básicas. La primera incluye el método más sencillo el FIGE (Field Inversion Gel Electrophoresis) La primera incluye el método más sencillo el FIGE (Field Inversion Gel Electrophoresis)

18 SISTEMA FIGE Es el equipo más simple diseñado para electroforesis en campo de inversión. Es el equipo más simple diseñado para electroforesis en campo de inversión. Funciona mediante la inversión periódica de la polaridad de los electrodos. Funciona mediante la inversión periódica de la polaridad de los electrodos. Somete el DNA a una reorientación de 180º. Somete el DNA a una reorientación de 180º.

19 SISTEMA FIGE Por lo que este gasta una cantidad de tiempo mayor en moverse hacia atrás. Por lo que este gasta una cantidad de tiempo mayor en moverse hacia atrás. Un módulo de control del campo eléctrico, una caja de gel standard vertical u horizontal con control de temperatura. Un módulo de control del campo eléctrico, una caja de gel standard vertical u horizontal con control de temperatura.

20 TIPOS DE SISTEMAS DE PFGE Los instrumentos de la siguiente categoría poseen la capacidad de reorientar el DNA en un pequeño ángulo oblicuo, generalmente entre 96 y 120º. Los instrumentos de la siguiente categoría poseen la capacidad de reorientar el DNA en un pequeño ángulo oblicuo, generalmente entre 96 y 120º. Esto hace que el DNA siempre se mueva hacia adelante en un patrón en zig-zag, dentro del gel. Esto hace que el DNA siempre se mueva hacia adelante en un patrón en zig-zag, dentro del gel.

21 TIPOS DE SISTEMAS DE PFGE Bajo un rango de tamaño y condiciones óptimas similares, estos equipos son más rápidos. Bajo un rango de tamaño y condiciones óptimas similares, estos equipos son más rápidos. Generan un amplio rango de tamaños en los fragmentos y proporcionan una porción útil más grande del gel comparados con FIGE Generan un amplio rango de tamaños en los fragmentos y proporcionan una porción útil más grande del gel comparados con FIGE

22 SISTEMA TAFE (TRANSVERSE ALTERNANTING FIELD ELECTROPHORESIS) Usa una complicada geometría entre sus electrodos y un gel localizado verticalmente, para obtener líneas rectas. Usa una complicada geometría entre sus electrodos y un gel localizado verticalmente, para obtener líneas rectas.

23 SISTEMA RGE (ROTATING GEL ELECTROPHORESIS) Mantiene un campo eléctrico homogéneo, en combinación con un gel horizontal. Mantiene un campo eléctrico homogéneo, en combinación con un gel horizontal. El campo eléctrico es fijo, para mover el DNA en una nueva dirección, el gel simplemente rota. El campo eléctrico es fijo, para mover el DNA en una nueva dirección, el gel simplemente rota.

24 SISTEMA CHEF (CLAMPED HOMOGENEOUS ELECTRIC FIELD ELECTROPHORESIS) Sistema que se caracteriza por obtener líneas rectas empleando para tal fin campos homogéneos. Sistema que se caracteriza por obtener líneas rectas empleando para tal fin campos homogéneos. 24 electrodos se disponen en arreglo hexagonal. 24 electrodos se disponen en arreglo hexagonal.

25 SISTEMA CHEF (CLAMPED HOMOGENEOUS ELECTRIC FIELD ELECTROPHORESIS) El voltaje de la fuente de poder se divide en esos electrodos de tal forma que el gradiente de voltaje que se produce es constante a lo largo de todo el gel. El voltaje de la fuente de poder se divide en esos electrodos de tal forma que el gradiente de voltaje que se produce es constante a lo largo de todo el gel. El ángulo de orientación de los campos puede variar entre 60 y 120º. El ángulo de orientación de los campos puede variar entre 60 y 120º.

26 APLICACIÓN DE LOS CAMPOS ELECTRICOS EN UN SISTEMA CHEF Cambia la dirección del campo eléctrico electrónicamente para reorientar el DNA, mediante cambio de la polaridad en el arreglo de electrodos. Cambia la dirección del campo eléctrico electrónicamente para reorientar el DNA, mediante cambio de la polaridad en el arreglo de electrodos.

27 BIO-RAD - CHEF DR III SYSTEM

28 BIO-RAD CHEF-DR III PULSED FIELD ELECTROPHORESIS SYSTEM Permite que grandes móleculas de DNA(del tamaño de cromosomas o millones de pares de bases), sean eficientemente separadas. Permite que grandes móleculas de DNA(del tamaño de cromosomas o millones de pares de bases), sean eficientemente separadas. El DNA obtenido de tal manera puede usarse para el análisis cariotipico. El DNA obtenido de tal manera puede usarse para el análisis cariotipico.

29 BIO-RAD CHEF-DR III PULSED FIELD ELECTROPHORESIS SYSTEM Los cromosomas pueden evaluarse para mapear las localizaciones de genes de interés, y el DNA digerido con endonucleasas de restricción puede evaluarse también para detectar polimorfismos de longitud. Los cromosomas pueden evaluarse para mapear las localizaciones de genes de interés, y el DNA digerido con endonucleasas de restricción puede evaluarse también para detectar polimorfismos de longitud. La cámara de 14 cm x 12.7 cm que contiene el gel de agarosa puede cargarse con más de 15 muestras (moldes de 6 mm x 1.5 mm ) y el módulo de enfriamiento se usa para mantener una temperatura constante al nivel operacional de 14° C. La cámara de 14 cm x 12.7 cm que contiene el gel de agarosa puede cargarse con más de 15 muestras (moldes de 6 mm x 1.5 mm ) y el módulo de enfriamiento se usa para mantener una temperatura constante al nivel operacional de 14° C.

30 TÉCNICA

31 OBTENCION DE LAS CEPAS BACTERIANAS Las bacterias de la muestra a aislar se ponen en crecimiento en el medio de cultivo apropiado, en condiciones microaerófilas (10% CO 2, 5% H 2 y 85% N 2 ), toda la noche a 42ºC. Las bacterias de la muestra a aislar se ponen en crecimiento en el medio de cultivo apropiado, en condiciones microaerófilas (10% CO 2, 5% H 2 y 85% N 2 ), toda la noche a 42ºC. Todos los aislados deben ser previamente identificados al nivel de especie por las técnicas standard. Todos los aislados deben ser previamente identificados al nivel de especie por las técnicas standard. Las suspensiones celulares se obtienen de la superficie de las cajas de cultivo, mediante un escobillón. Las suspensiones celulares se obtienen de la superficie de las cajas de cultivo, mediante un escobillón.

32 PREPARACION DE LOS INSERTOS PLUGS DE AGAROSA Las suspensiones se hacen en tubo seco con 2 ml de buffer salino fosfatado (PBS: 0,01 fosphate buffer, [pH 7,4] o con buffer de suspensión celular (CBS 100mM Tris, 100mM EDTA, pH 8). Las suspensiones se hacen en tubo seco con 2 ml de buffer salino fosfatado (PBS: 0,01 fosphate buffer, [pH 7,4] o con buffer de suspensión celular (CBS 100mM Tris, 100mM EDTA, pH 8). Cada suspensión celular fue ajustada a una densidad óptica de 0,35 a 0,45 usando un turbidímetro. Cada suspensión celular fue ajustada a una densidad óptica de 0,35 a 0,45 usando un turbidímetro.

33 PREPARACION DE LOS INSERTOS PLUGS DE AGAROSA Esto corresponde a valores de absorbancia de 0,570 a 0,820 a una longitud de onda de 610 nm usando un espectrofotómetro. Esto corresponde a valores de absorbancia de 0,570 a 0,820 a una longitud de onda de 610 nm usando un espectrofotómetro. Una alícuota de 400 microl de la suspensión se transfieren a tubos de 1,5 ml de una microcentrífuga con 25 microl de proteinasa K, y mezclados por agitación suave 3 o 4 veces. Una alícuota de 400 microl de la suspensión se transfieren a tubos de 1,5 ml de una microcentrífuga con 25 microl de proteinasa K, y mezclados por agitación suave 3 o 4 veces.

34 PREPARACION DE LOS INSERTOS PLUGS DE AGAROSA Otros 400 microl de agarosa fundida al 1% en TE (100mM Tris, 100mM EDTA, pH 8) son adicionados a la suspensión celular, y mezclados suavemente con una pipeta hacia arriba y abajo por 3 veces. Otros 400 microl de agarosa fundida al 1% en TE (100mM Tris, 100mM EDTA, pH 8) son adicionados a la suspensión celular, y mezclados suavemente con una pipeta hacia arriba y abajo por 3 veces. La suspensión así obtenida fue vertida de inmediato en unos moldes reutilizables para obtener los plugs. La suspensión así obtenida fue vertida de inmediato en unos moldes reutilizables para obtener los plugs.

35 PREPARACION DE LOS INSERTOS PLUGS DE AGAROSA Posteriormente los plugs, se dejan a solidificar a temperatura ambiente por 15 minutos, o en nevera a 4ºC por 5 minutos. Posteriormente los plugs, se dejan a solidificar a temperatura ambiente por 15 minutos, o en nevera a 4ºC por 5 minutos.

36 LISIS CELULAR EN LOS PLUGS Los plugs se llevan a tubos de 50 ml, que contienen buffer de lisis (50mM Tris, 50mM EDTA, [pH 8], 1% de sarcocina, 0,1 de proteinasa K/ml). Los plugs se llevan a tubos de 50 ml, que contienen buffer de lisis (50mM Tris, 50mM EDTA, [pH 8], 1% de sarcocina, 0,1 de proteinasa K/ml). La lisis se deja llevar a cabo por 15 min. en un agitador orbital de agua, con constante y vigorosa agitación. La lisis se deja llevar a cabo por 15 min. en un agitador orbital de agua, con constante y vigorosa agitación. Aquí los tiempos de lisis varían según la cepa bacteriana y varían entre 0,25, 0,5, 1, y 2 horas. Aquí los tiempos de lisis varían según la cepa bacteriana y varían entre 0,25, 0,5, 1, y 2 horas.

37 LAVADO Después de la lisis los plugs, se lavan 3 o 4 veces, 15 a 20 min. por lavado a 54ºC. Después de la lisis los plugs, se lavan 3 o 4 veces, 15 a 20 min. por lavado a 54ºC. Una vez con agua estéril ultrapura y tres veces con buffer TE [pH 8]. Una vez con agua estéril ultrapura y tres veces con buffer TE [pH 8]. Tanto el agua como el buffer se precalientan a 54ºC. Tanto el agua como el buffer se precalientan a 54ºC. Luego de el último lavado, se adicionan 5 ml de buffer TE fresco a Tº ambiente. Luego de el último lavado, se adicionan 5 ml de buffer TE fresco a Tº ambiente.

38 DIGESTIÓN POR ENZIMAS DE RESTRICCION Una amplia lámina de 2mm se corta de cada plug con un bisturí o con una cuchilla de afeitar. Una amplia lámina de 2mm se corta de cada plug con un bisturí o con una cuchilla de afeitar. Y se transfiere a un tubo que contiene 1 X de buffer de restricción con la cantidad especificada de la enzima de restricción. Y se transfiere a un tubo que contiene 1 X de buffer de restricción con la cantidad especificada de la enzima de restricción. La elección de esta varía en la literatura internacional dependiendo de la cepa ?, al igual que el tiempo de incubación. La elección de esta varía en la literatura internacional dependiendo de la cepa ?, al igual que el tiempo de incubación.

39 ENZIMAS DE RESTRICCION

40 DIGESTIÓN POR ENZIMAS DE RESTRICCION Las láminas se incuban a temperatura ambiente (23 a 25ºC por 2 horas). Las láminas se incuban a temperatura ambiente (23 a 25ºC por 2 horas). Antes de moldear el gel, la mezcla de restricción es reemplazada por 200 microl de buffer TBE (10 X TBE = 0,89 M de Tris borado, 0,02 EDTA, pH 8,3) Antes de moldear el gel, la mezcla de restricción es reemplazada por 200 microl de buffer TBE (10 X TBE = 0,89 M de Tris borado, 0,02 EDTA, pH 8,3) Las láminas se llevan a Tº ambiente por 5 min, y luego se llevan al recipiente apropiado para electroforesis con gel de agarosa SKG al 1%. Las láminas se llevan a Tº ambiente por 5 min, y luego se llevan al recipiente apropiado para electroforesis con gel de agarosa SKG al 1%.

41 ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSADO (PFGE) El gel se prepara en agarosa SKG al 1% en TE 0,5 X (Tris 0,1 M, Ácido bórico 0,08 M, EDTA 0,1 mM). El gel se prepara en agarosa SKG al 1% en TE 0,5 X (Tris 0,1 M, Ácido bórico 0,08 M, EDTA 0,1 mM). Existen diversos protocolos en lo referente a la duración e intensidad de los pulsos eléctricos. Existen diversos protocolos en lo referente a la duración e intensidad de los pulsos eléctricos.

42 ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSADO (PFGE) En el protocolo de PFEG del CDC para tipificación del C. Jejuni, usaron un tiempo inicial de switch de 6,75 seg. con un switch final de 38,35 sg. En el protocolo de PFEG del CDC para tipificación del C. Jejuni, usaron un tiempo inicial de switch de 6,75 seg. con un switch final de 38,35 sg. En un gradiente de 6V x cm. y un ángulo incluido de 120º. En un gradiente de 6V x cm. y un ángulo incluido de 120º.

43 ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSADO (PFGE) Estos valores de tiempo switch pueden calcularse usando la función de auto-algoritmo del CHEF mapper (Bio-Rad), para separar fragmentos en el rango de 50 a 400 kpb. Estos valores de tiempo switch pueden calcularse usando la función de auto-algoritmo del CHEF mapper (Bio-Rad), para separar fragmentos en el rango de 50 a 400 kpb. En este equipo el tiempo total estimado de electroforesis es de 18 horas. En este equipo el tiempo total estimado de electroforesis es de 18 horas.

44 ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSADO (PFGE) Después de completada la electroforesis, los geles se tiñen con 400 ml de solución de Bromuro de Etidio (50 microg/ml) Después de completada la electroforesis, los geles se tiñen con 400 ml de solución de Bromuro de Etidio (50 microg/ml) Y el patrón de bandas se observa bajo iluminación con rayos UV. Y el patrón de bandas se observa bajo iluminación con rayos UV. Y se fotografían con cámara polaroid. Y se fotografían con cámara polaroid.

45 ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSADO (PFGE) La imagen digitalizada del gel se introduce al programa Quanty one - Discovery Series (Bio-Rad), donde se estima el peso molecular de cada fragmento. La imagen digitalizada del gel se introduce al programa Quanty one - Discovery Series (Bio-Rad), donde se estima el peso molecular de cada fragmento. El programa tiene la capacidad de tener en cuenta los defectos de migración como sonrisas o líneas convergentes, al estimar los pesos moleculares, siendo así más preciso. El programa tiene la capacidad de tener en cuenta los defectos de migración como sonrisas o líneas convergentes, al estimar los pesos moleculares, siendo así más preciso.

46 ANALISIS COMPUTADORIZADO PARA LOS PATRONES DE PFGE En el protocolo del CDC los patrones fueron analizados usando el software Molecular analyst fingerprinting package (version 1,2 Bio-Rad). En el protocolo del CDC los patrones fueron analizados usando el software Molecular analyst fingerprinting package (version 1,2 Bio-Rad). Determinándose así el error intra o intergeles Determinándose así el error intra o intergeles Las imágenes se normalizan, por alineación de los picos de una cepa standard, misma que se carga en dos o tres líneas de cada gel. Las imágenes se normalizan, por alineación de los picos de una cepa standard, misma que se carga en dos o tres líneas de cada gel.

47 TECNICA FINAL

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49 INTRODUCCIÓN Frecuentemente los microbiólogos clínicos se ven abocados a a determinar la relación de un grupo de aislamientos bacterianos, en el evento de un brote epidémico. Frecuentemente los microbiólogos clínicos se ven abocados a a determinar la relación de un grupo de aislamientos bacterianos, en el evento de un brote epidémico.

50 INTRODUCCIÓN En la última década los métodos tradicionales de tipificación de bacterias han sido reemplazados por nuevos métodos moleculares como fingerprinting de plásmidos, ribotipificación, PCR y análisis de patrones de restricción del DNA cromosómico por PFEG. En la última década los métodos tradicionales de tipificación de bacterias han sido reemplazados por nuevos métodos moleculares como fingerprinting de plásmidos, ribotipificación, PCR y análisis de patrones de restricción del DNA cromosómico por PFEG.

51 INTRODUCCIÓN Aún presentan utilidad ciertos métodos como la tipificación por bacteriófagos para el estudio del Staphylococcus Aureus. Aún presentan utilidad ciertos métodos como la tipificación por bacteriófagos para el estudio del Staphylococcus Aureus. La serotipificación resulta aún útil como herramienta de vigilancia epidemiológica de vigilancia para especies de Salmonella. La serotipificación resulta aún útil como herramienta de vigilancia epidemiológica de vigilancia para especies de Salmonella.

52 INTRODUCCIÓN Sin embargo existe la necesidad de un método de tipificación de cepas que pueda ser utilizado en un amplio grupo de especies bacterianas. Sin embargo existe la necesidad de un método de tipificación de cepas que pueda ser utilizado en un amplio grupo de especies bacterianas. En el presente la PFGE esta muy cerca de satisfacer esta necesidad. En el presente la PFGE esta muy cerca de satisfacer esta necesidad.

53 INTRODUCCIÓN PFGE implica el embeber organismos en agarosa. PFGE implica el embeber organismos en agarosa. Lisis bacteriana in situ. Lisis bacteriana in situ. Digestión del DNA cromosómico con endonucleasas de restricción. Digestión del DNA cromosómico con endonucleasas de restricción. Los Fxs de DNA se aíslan en un patrón de bandas discretas en el gel, por medio de un aparato que cambia la dirección de la corriente en un patrón predeterminado. Los Fxs de DNA se aíslan en un patrón de bandas discretas en el gel, por medio de un aparato que cambia la dirección de la corriente en un patrón predeterminado.

54 INTRODUCCIÓN Actualmente no existen criterios standard para el análisis de los patrones de los fragmentos. Actualmente no existen criterios standard para el análisis de los patrones de los fragmentos. Consecuentemente varios investigadores pueden llegar a diferentes conclusiones sobre si los aislados pertenecen o no, a la cepa del brote. Consecuentemente varios investigadores pueden llegar a diferentes conclusiones sobre si los aislados pertenecen o no, a la cepa del brote.

55 INTRODUCCIÓN Este artículo propone unas guías para la interpretación para los patrones de restricción del DNA generados por PFGE. Este artículo propone unas guías para la interpretación para los patrones de restricción del DNA generados por PFGE. En un esfuerzo por hacer del PFGE un método más comprensible, se abolieron los métodos estadísticos. En un esfuerzo por hacer del PFGE un método más comprensible, se abolieron los métodos estadísticos.

56 DEFINICIONES Aislado: Es un término general para un cultivo puro de bacterias obtenido de un subcultivo de una colonia simple desde una caja de aislamiento primario, presumiblemente derivado de un organismo simple, pero sin información disponible acerca de su género o especie. Aislado: Es un término general para un cultivo puro de bacterias obtenido de un subcultivo de una colonia simple desde una caja de aislamiento primario, presumiblemente derivado de un organismo simple, pero sin información disponible acerca de su género o especie.

57 DEFINICIONES Aislados epidemiológicamente relacionados: Son aislados cultivados de especímenes recolectados de pacientes, fómites o del medio ambiente durante un corto período, en un área bien definida, como parte de una investigación epidemiológica que sugiere, estos pueden ser derivados de una fuente común Aislados epidemiológicamente relacionados: Son aislados cultivados de especímenes recolectados de pacientes, fómites o del medio ambiente durante un corto período, en un área bien definida, como parte de una investigación epidemiológica que sugiere, estos pueden ser derivados de una fuente común

58 DEFINICIONES Aislados genéticamente relacionados (clones): Son aislados que son indistinguibles de otros por una variedad de test genéticos, o que son tan similares que se presume son derivados de una fuente parental común. Aislados genéticamente relacionados (clones): Son aislados que son indistinguibles de otros por una variedad de test genéticos, o que son tan similares que se presume son derivados de una fuente parental común.

59 DEFINICIONES Brote: Un brote es el aumento de la incidencia de una enfermedad infecciosa en un sitio específico, durante un período dado y que esta por encima de la rata de la línea de base para un lugar y un tiempo dado. Brote: Un brote es el aumento de la incidencia de una enfermedad infecciosa en un sitio específico, durante un período dado y que esta por encima de la rata de la línea de base para un lugar y un tiempo dado.

60 DEFINICIONES Cepa: Es un aislado o un grupo de aislados que pueden distinguirse de otros de los mismos géneros y especies por las características fenotípicas y/o genotípicas. Una cepa es una subdivisión descriptiva de una especie. Cepa: Es un aislado o un grupo de aislados que pueden distinguirse de otros de los mismos géneros y especies por las características fenotípicas y/o genotípicas. Una cepa es una subdivisión descriptiva de una especie.

61 DEFINICIONES Cepa del brote: Son aislados de la misma especie que son tanto epidemiológica (tiempo, lugar y fuente de infección común) y genéticamente relacionadas. Tales aislados puede asumirse que están clonalmente relacionados. Cepa del brote: Son aislados de la misma especie que son tanto epidemiológica (tiempo, lugar y fuente de infección común) y genéticamente relacionadas. Tales aislados puede asumirse que están clonalmente relacionados.

62 DEFINICIONES Cepas endémicas: Son aislados que se recobran frecuentemente de pacientes infectados bajo el marco de una institución de salud o comunidad, y que son indistinguibles o estrechamente relacionados a otras por métodos de tipificación, pero que no tienen asociación epidemiológica directa que pueda ser demostrada. Cepas endémicas: Son aislados que se recobran frecuentemente de pacientes infectados bajo el marco de una institución de salud o comunidad, y que son indistinguibles o estrechamente relacionados a otras por métodos de tipificación, pero que no tienen asociación epidemiológica directa que pueda ser demostrada.

63 METAS PARA LA TIPIFICACION DE CEPAS La meta es proveer evidencia de que AER recolectados durante el brote de la enfermedad son también GR y representan la misma cepa. La meta es proveer evidencia de que AER recolectados durante el brote de la enfermedad son también GR y representan la misma cepa. Información útil para el entendimiento y control de la extensión de enfermedades en hospitales y comunidades. Información útil para el entendimiento y control de la extensión de enfermedades en hospitales y comunidades.

64 METAS PARA LA TIPIFICACION DE CEPAS El análisis de resultados para el control de infecciones se basa en: -Si la cepa del brote es de una progenie reciente o de un precursor común. -Si tales aislados son del mismo genotipo. -Si AER tienen diferentes genotípos El análisis de resultados para el control de infecciones se basa en: -Si la cepa del brote es de una progenie reciente o de un precursor común. -Si tales aislados son del mismo genotipo. -Si AER tienen diferentes genotípos

65 ¿DE DONDE OBTENER LOS AISLADOS? De pacientes, fómites y fuentes ambientales, que estén relacionados con: - El área donde las infecciones están ocurriendo. - El período durante el cual las infecciones ocurrieron. - La fuente común de infección. De pacientes, fómites y fuentes ambientales, que estén relacionados con: - El área donde las infecciones están ocurriendo. - El período durante el cual las infecciones ocurrieron. - La fuente común de infección.

66 ANALISIS Los estudios de tipificación hechos en aislados en los cuales la información epidemiológica no está disponible, puede conducir a información errada. Los estudios de tipificación hechos en aislados en los cuales la información epidemiológica no está disponible, puede conducir a información errada. La tipificación de las cepas no sustituye los datos epidemiológicos. La tipificación de las cepas no sustituye los datos epidemiológicos. Por lo tanto dos sets de datos deben desarrollarse independientemente, pero ser analizados juntos. Por lo tanto dos sets de datos deben desarrollarse independientemente, pero ser analizados juntos.

67 CRITERIOS INTERPRETATIVOS Para interpretar los patrones de fragmentos de DNA generados por PFGE y transformarlos en información epidemiológicamente útil, el microbiólogo debe entender como comparar estos patrones y cómo los eventos genéticos al azar pueden alterarlos. Para interpretar los patrones de fragmentos de DNA generados por PFGE y transformarlos en información epidemiológicamente útil, el microbiólogo debe entender como comparar estos patrones y cómo los eventos genéticos al azar pueden alterarlos.

68 CRITERIOS INTERPRETATIVOS Eventos genéticos al azar: Mutaciones puntuales, inserciones y deleciones del DNA alteran los patrones de PFGE durante el curso de un brote. Eventos genéticos al azar: Mutaciones puntuales, inserciones y deleciones del DNA alteran los patrones de PFGE durante el curso de un brote. El conocimiento de éstos permite al microbiólogo asignar al aislado a una de cuatro categorías. El conocimiento de éstos permite al microbiólogo asignar al aislado a una de cuatro categorías.

69 CRITERIOS INTERPRETATIVOS Los criterios propuestos son fidedignos si la PFGE demuestra al menos 10 fragmentos distintos. Los criterios propuestos son fidedignos si la PFGE demuestra al menos 10 fragmentos distintos. Cuando son menos la veracidad y habilidad discriminatoria de los criterios se desconoce. Cuando son menos la veracidad y habilidad discriminatoria de los criterios se desconoce.

70 ASIGNACIÓN DE CATEGORÍAS Lo primero es comparar el patrón del brote, con el patrón de la cepa aislada. Lo primero es comparar el patrón del brote, con el patrón de la cepa aislada. Tamaño y número de los fragmentos. Tamaño y número de los fragmentos. Con base en el apareo de fragmento por fragmento de cada aislamiento, se clasifica entonces según su relación con la cepa del brote. Con base en el apareo de fragmento por fragmento de cada aislamiento, se clasifica entonces según su relación con la cepa del brote.

71 ASIGNACIÓN DE CATEGORÍAS Patrones distintivamente diferentes de el del brote (< 50% fxs comunes) se consideran tipos no relacionados. Patrones distintivamente diferentes de el del brote (< 50% fxs comunes) se consideran tipos no relacionados. Patrones que difieren en dos o tres fragmentos se consideran subtipos del patrón del brote. Patrones que difieren en dos o tres fragmentos se consideran subtipos del patrón del brote.

72 CATEGORIAS Indistinguible: Los aislados se designan como genéticamente indistinguibles, si las bandas de los patrones de restricción tienen el mismo número y tamaño aparente. Indistinguible: Los aislados se designan como genéticamente indistinguibles, si las bandas de los patrones de restricción tienen el mismo número y tamaño aparente.

73 CATEGORÍAS Estrechamente Relacionada: Un aislado cae dentro de esta categoría, si los patrones de PFEG difieren de los del brote por cambios generados por un simple evento genético (mutación puntual, inserción o deleción). Tales cambios presentan diferencias en dos o tres bandas. Estrechamente Relacionada: Un aislado cae dentro de esta categoría, si los patrones de PFEG difieren de los del brote por cambios generados por un simple evento genético (mutación puntual, inserción o deleción). Tales cambios presentan diferencias en dos o tres bandas.

74 EFECTO DE LOS EVENTOS GENÉTICOS EN LOS PATRONES PFEG Mutación puntual resultante en un sitio de restricción: La cepa alterada puede carecer de un fragmento presente en el patrón del brote, y concomitantemente generarse dos pequeños fragmentos no presentes en la cepa original, las sumas de estos deben aproximarse al tamaño del original. A esto se considera una diferencia de tres fragmentos. Mutación puntual resultante en un sitio de restricción: La cepa alterada puede carecer de un fragmento presente en el patrón del brote, y concomitantemente generarse dos pequeños fragmentos no presentes en la cepa original, las sumas de estos deben aproximarse al tamaño del original. A esto se considera una diferencia de tres fragmentos.

75 MUTACION PUNTUAL GENERADORA DE UN SITIO DE RESTRICCION

76 EFECTO DE LOS EVENTOS GENÉTICOS EN LOS PATRONES PFEG Mutación puntual resultante en pérdida de un sitio de restricción: La cepa alterada puede tener un nuevo fragmento de mayor tamaño no presente en la cepa del brote, habiendo perdido dos pequeños fragmentos. Esta es una diferencia de tres fragmentos. Mutación puntual resultante en pérdida de un sitio de restricción: La cepa alterada puede tener un nuevo fragmento de mayor tamaño no presente en la cepa del brote, habiendo perdido dos pequeños fragmentos. Esta es una diferencia de tres fragmentos.

77 MUTACION PUNTUAL CON PERDIDA DE UN SITIO DE RESTRICCION

78 EFECTO DE LOS EVENTOS GENÉTICOS EN LOS PATRONES PFEG Inserción de DNA dentro de un fragmento de restricción preexistente: La cepa alterada puede tener el mismo número de fragmentos que la cepa del brote, pero esta carece de un pequeño fragmento generándose un nuevo fragmento de mayor tamaño. A esta diferencia se le conoce como desviación de fragmento Inserción de DNA dentro de un fragmento de restricción preexistente: La cepa alterada puede tener el mismo número de fragmentos que la cepa del brote, pero esta carece de un pequeño fragmento generándose un nuevo fragmento de mayor tamaño. A esta diferencia se le conoce como desviación de fragmento

79 INSERCION DE DNA EN UN FX DE RESTRICCION

80 EFECTO DE LOS EVENTOS GENÉTICOS EN LOS PATRONES PFEG Deleción de DNA de un fragmento: La cepa alterada puede mostrar un nuevo fragmento de menor tamaño con perdida de un fragmento mayor. Esta es una diferencia de dos fragmentos. Deleción de DNA de un fragmento: La cepa alterada puede mostrar un nuevo fragmento de menor tamaño con perdida de un fragmento mayor. Esta es una diferencia de dos fragmentos.

81 DELECIÓN DE DNA DE UN FRAGMENTO

82 CATEGORIAS Posiblemente relacionada: Un aislado se considera posiblemente relacionado si el patrón de PFGE, difiere del patrón del brote por cambios consistentes en dos eventos genéticos independientes. Posiblemente relacionada: Un aislado se considera posiblemente relacionado si el patrón de PFGE, difiere del patrón del brote por cambios consistentes en dos eventos genéticos independientes.

83 CATEGORÍAS Diferencias de 4 a 6 bandas pueden explicarse por inserciones o deleciones simples, o por ganancia o pérdida de sitios de restricción. Diferencias de 4 a 6 bandas pueden explicarse por inserciones o deleciones simples, o por ganancia o pérdida de sitios de restricción. Los aislados al no ser genéticamente estrechamente relacionados a la cepa del brote es menos probable que estén relacionados epidemiológicamente. Los aislados al no ser genéticamente estrechamente relacionados a la cepa del brote es menos probable que estén relacionados epidemiológicamente.

84 CATEGORIAS No Relacionado: Un aislado se considera no relacionado a la cepa del brote si su patrón de PFGE, difiere por cambios consistentes con 3 o más eventos genéticos independientes (diferencias de 7 o más bandas). Esto implica que < 50% de los fragmentos de tal aislado están presentes en la cepa del brote. No Relacionado: Un aislado se considera no relacionado a la cepa del brote si su patrón de PFGE, difiere por cambios consistentes con 3 o más eventos genéticos independientes (diferencias de 7 o más bandas). Esto implica que < 50% de los fragmentos de tal aislado están presentes en la cepa del brote.

85 MÉTODO DE REPORTE El patrón de restricción de DNA de la cepa del brote se reporta como tipo A. El patrón de restricción de DNA de la cepa del brote se reporta como tipo A. Si el aislado tiene todos los patrones de la cepa original, hace parte del brote. Si el aislado tiene todos los patrones de la cepa original, hace parte del brote. Patrones estrecha o posiblemente relacionados, se consideran subtipos de A y se nombran A1 y A2. Patrones estrecha o posiblemente relacionados, se consideran subtipos de A y se nombran A1 y A2.

86 MÉTODO DE REPORTE Los aislados estrechamente o posiblemente relacionados según los patrones de restricción se reportan como probable o posiblemente relacionados epidemiológicamente. Los aislados estrechamente o posiblemente relacionados según los patrones de restricción se reportan como probable o posiblemente relacionados epidemiológicamente. Los patrones que difieren sustancialmente del patrón del brote y que se clasifican como no relacionados se designan con los tipos B y C. Los patrones que difieren sustancialmente del patrón del brote y que se clasifican como no relacionados se designan con los tipos B y C.

87 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIÓN DE PFEG

88 CONSIDERACIONES GENERALES PARA EL USO DE LAS GUIAS Esas guías fueron diseñadas para analizar pequeños sets de aislados obtenidos durante brotes potenciales en hospitales o comunidades en periodos relativamente cortos. Esas guías fueron diseñadas para analizar pequeños sets de aislados obtenidos durante brotes potenciales en hospitales o comunidades en periodos relativamente cortos.

89 CONSIDERACIONES GENERALES PARA EL USO DE LAS GUIAS Los criterios para la identificación de las cepas son estrictos y no son apropiados para estudios de grandes poblaciones de aislados recolectados en periodos de más de un año. Los criterios para la identificación de las cepas son estrictos y no son apropiados para estudios de grandes poblaciones de aislados recolectados en periodos de más de un año.

90 CONSIDERACIONES GENERALES PARA EL USO DE LAS GUIAS Laboratorios de referencia que investigan relaciones potenciales entre los aislados por periodos extendidos, deben modificar estos criterios y reacomodarse al uso de múltiples enzimas y análisis. Laboratorios de referencia que investigan relaciones potenciales entre los aislados por periodos extendidos, deben modificar estos criterios y reacomodarse al uso de múltiples enzimas y análisis. Diferentes enzimas de restricción han probado ser útiles para el análisis de PFGE de diferentes especies bacterianas. Diferentes enzimas de restricción han probado ser útiles para el análisis de PFGE de diferentes especies bacterianas.

91 DATOS REPRESENTATIVOS PARA BACTERIAS ANALIZADAS POR PFEG

92 CONSIDERACIONES GENERALES PARA EL USO DE LAS GUIAS Antes de que PFGE pueda ser considerado disponible para la tipificación de especies bacterianas, la técnica debe ser validada. Antes de que PFGE pueda ser considerado disponible para la tipificación de especies bacterianas, la técnica debe ser validada.

93 CONTROLES Una cepa bien caracterizada debe ser procesada junto con los aislados desconocidos a evaluarse. Una cepa bien caracterizada debe ser procesada junto con los aislados desconocidos a evaluarse. Un tamaño molecular estándar debe correrse en al menos una línea del gel para proveer orientación del tamaño de los fragmentos (línea externa o línea de la mitad). Un tamaño molecular estándar debe correrse en al menos una línea del gel para proveer orientación del tamaño de los fragmentos (línea externa o línea de la mitad).

94 CONTROLES Si se obtienen los resultados esperados con el organismo de control, se puede afirmar: - El procedimiento, incluyendo lisis celular, lavado y digestión por endonucleasas, fue hecho apropiadamente. - El gel y las condiciones electroforéticas fueron apropiadas. - Las condiciones del procedimiento condujeron a resultados que son reproducibles. Si se obtienen los resultados esperados con el organismo de control, se puede afirmar: - El procedimiento, incluyendo lisis celular, lavado y digestión por endonucleasas, fue hecho apropiadamente. - El gel y las condiciones electroforéticas fueron apropiadas. - Las condiciones del procedimiento condujeron a resultados que son reproducibles.

95 CONTROLES Los estándares son necesarios para evaluar las diferencias menores de perfil que puedan resultar de un cambio genético simple. Los estándares son necesarios para evaluar las diferencias menores de perfil que puedan resultar de un cambio genético simple. En la mayoría de los casos los estimados visuales del tamaño de los fragmentos son adecuados para la interpretación de las diferencias de perfil en PFGE. En la mayoría de los casos los estimados visuales del tamaño de los fragmentos son adecuados para la interpretación de las diferencias de perfil en PFGE.

96 CONTROLES Entre los estándares moleculares comúnmente usados están: - Fagos Lamda - Tapones de agarosa que contienen fragmentos de restricción de DNA del Saccharomyces cerevisiae. - Fragmentos restricción de DNA de varios organismos bien caracterizados, como S. aureus, Enterococus faecium, E colí, etc. Entre los estándares moleculares comúnmente usados están: - Fagos Lamda - Tapones de agarosa que contienen fragmentos de restricción de DNA del Saccharomyces cerevisiae. - Fragmentos restricción de DNA de varios organismos bien caracterizados, como S. aureus, Enterococus faecium, E colí, etc.

97 CEPAS BACTERIANAS CON PATRONES DE RESTRICCION CONOCIDOS

98

99 SEGURIDAD Tres tópicos de seguridad deben tocarse antes de aplicar PFGE a una bacteria patógena: - Riesgos asociados a la propagación de la bacteria. - Manipulación y disposición de reactivos químicos. - Riesgo de shock eléctrico. Tres tópicos de seguridad deben tocarse antes de aplicar PFGE a una bacteria patógena: - Riesgos asociados a la propagación de la bacteria. - Manipulación y disposición de reactivos químicos. - Riesgo de shock eléctrico.

100 SEGURIDAD Se deben tomar precauciones para evitar la producción de aerosoles durante la centrifugación. Se deben tomar precauciones para evitar la producción de aerosoles durante la centrifugación. Prevenir la liberación del agente infeccioso al medio por ruptura de pipetas o tubos. Prevenir la liberación del agente infeccioso al medio por ruptura de pipetas o tubos. Precaución especial con agentes infecciosos que colonizan por la vía respiratoria. Precaución especial con agentes infecciosos que colonizan por la vía respiratoria.

101 SEGURIDAD Precaución con bacterias que requieren bajas dosis de inoculación para ser patógenas (Shigella, E colí). Precaución con bacterias que requieren bajas dosis de inoculación para ser patógenas (Shigella, E colí). Químicos peligrosos como el Bromuro de Etidio, que es un poderoso mutágeno. Químicos peligrosos como el Bromuro de Etidio, que es un poderoso mutágeno. Fenilmetilsulfonil fluorado, destructor de las mucosas de tracto respiratorio, ojos y piel, fatal si se ingiere o inhala. Fenilmetilsulfonil fluorado, destructor de las mucosas de tracto respiratorio, ojos y piel, fatal si se ingiere o inhala.

102 SEGURIDAD La separación de los grandes fragmentos de DNA en el gel de electroforesis por PFGE, se debe a los altos voltajes eléctricos. La separación de los grandes fragmentos de DNA en el gel de electroforesis por PFGE, se debe a los altos voltajes eléctricos. Goteos en el sistema de recirculación del buffer pueden someter al operador a altos voltajes. Goteos en el sistema de recirculación del buffer pueden someter al operador a altos voltajes.

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