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Genética y genómica de los desórdenes hematológicos.

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1 Genética y genómica de los desórdenes hematológicos

2 Índice Leucemias Clasificación Aberraciones cromosómicas Rearreglos cromosómicos Desregulación génica Desequilibrios cromosómicos Ganancia de función Pérdida de función Herramientas genómicas Perfil de expresión génica Microarreglos Aplicaciones Diagnóstico Pronóstico

3 Genómica cancers are typically initiated by acquired alterations to the genome of the cancer cell, such as chromosomal translocations, mutations, and deletions. The diagnosis of the hematologic cancers is commonly based on morphologic evaluation supplemented by analysis of a few molecular markers.

4 Leucemias Grupo heterogéneo de desórdenes neoplásicos de los leucocitos. De acuerdo a su origen se clasifican en: Mieloides Linfoides De acuerdo a su evolución (sin Tx.) Agudas Crónicas

5 Leucemias Leucemia linfocítica crónica (LLC): expansión monoclonas de linfocitos (95% linfos B). Leucemia linfoblástica aguda (LLA): Desorden monoclonal maligno de los precursores linfopoyéticos. Leucemia mieloide crónica (LMC): proliferación no controlada de granulocitos Leucemia mieloide aguda (LMA): Trastorno de los precursores de celulas hematopoyéticas. De acuerdo al sistema francés- americano-británico se sub-dividen en 6 grupos.

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7 Etiología La causa de la expansión clonal no se conoce totalmente. Involucra algunos re-arreglos de ADN. Factores externos: agentes alquilantes, medicamentos, radiaciones ionizantes y substancias químicas. Factores internos: Anormalidades cromosómicas que dan lugar a cambios en el ADN.

8 Etiología Sd. de inestabilidad cromosómica Anemia de Fanconi Sd. mielodisplásico Leucemia mieloide aguda Sd. de Bloom

9 Agentes que producen Aberraciones cromosómicas Tx con agentes alquilantes: Se asocian a anomalías cromosómicas No balanceadas. Pérdidas o deleción de Cr. 5 o 7 o ambos. Síndrome mielodisplásico y leucemia mieloide aguda. Tx con inhibidores de Topoisomerasa II: Se asocian a anomalías balanceadas Traslocaciones 11q23.1 (gen MLL) LLA.

10 Anormalidades cromosómicas Los rearreglos cromosómicos pueden dar lugar a alteración en la estructura o regulación de oncogenes. Se consideran eventos iniciales en la carcinogénesis Principales clases de anomalías cromosómicas: Rearreglos cromosómicos balanceados Rearreglos No balanceados Translocaciones recíprocas Inversiones Inserciones

11 Rearreglos cromosómicos Balanceados Re-arreglos cromosómicos balanceados dan lugar a: Formación de quimeras por fusión génica. Resulta en la expresión de una proteína quimérica con una actividad nueva o alterada. Cambios cromosómicos que producen desregulación de un gen estructuralmente normal. Da lugar a la expresión des-regulada de una proteína normal.

12 Chromosomal Abnormalities in Human Cancer

13 Rearreglos y genes Algunas translocaciones asociadas a leucemia en la infancia aparecen in útero. Los re-arreglos Cr. están asociados a genes específicos (MLL, ETV6, y NUP98) que se encuentran en estados patológiocs específicos. BCR-ABL1 es un gen resultado de una fusión que sirve para evaluar respuesta a Tx. de cáncer.

14 Fusión quimérica de genes Genes que participan en la formación de una quimera Tirosin quinasas Factores de trascripción. El cromosoma Filadelfia resulta de la formación de un gen fusionado quimérico. El cromosoma 22 truncado está presente en: Casi todos los pacientes con leucemia mieloide crónica (LMC). 20% de los pacientes con leucemia linfoblástica aguda (LLA). Raros casos de leucemia mieloide aguda (LMA).

15 Cromosoma Filadelfia Translocación recíproca t(9;22)(q34.1;q11.23) Las secuencias del gen BCR en la banda 22q11.23, se unen a las porciones del gen que codifica para la tirosin quinasa citoplásmica ABL1 en la banda 9q34.1

16 CR Filadelfia En1973 Rowley observ ó que el cromosoma Ph era el resultado de una traslocaci ó n rec í proca que involucraba tambi é n el cromosoma 9. La anormalidad se conoce como t(9;22)(q34;q11). En 1980 se demostr ó que el cromosoma Ph ten í a un gen con una fusi ó n denominada BCR-ABL. Se piensa que esta es la principal causa de la fase cr ó nica de la LMC.

17 Rearreglos en Leucemias. Cr Filadelfia Leucemia mieloide crónica (LMC) y Leucemia linfoblástica aguda (LLA): El rearreglo t(9;22)(q34.1;q11.23) da lugar a la expresión de una proteína quimérica con actividad de tirosin quinasa, en ausencia de las señales fisiológicas de activación. El cromosoma Filadelfia es el resulatdo de esta translocación. Las secuencias de BCR en el gen de la banda 22q11.23 se fusiona a la parte del gen que codifica a la tirosin quinasa citoplásmica localizado en la banda 9q34.1.

18 The t(9;22) Translocation and Its Products: the BCR-ABL Oncogene on the Ph Chromosome and the Reciprocal ABL-BCR on the Derivative 9q+ Chromosome

19 Functional Consequences of Balanced Chromosomal Rearrangements

20 Aberraciones cromosómicas: Aplicación de su conocimiento Demuestran que los cánceres en humanos pueden aparecer por alteraciones genéticas adquiridas en las células somáticas La señal de tirosin-quinasa aberrante en la LMC dio lugar a el uso de inhibidores selectivos: Imatinib mesilato. Las mutaciones de los dominios de quinasa resistentes a imatinib son responsables de la mayor parte de los casos de recaída. Una nueva generación de medicamentos ha sido desarrollada (dasatinib and nilotinib).

21 Moléculas blanco: Imatinib BCR ABL Leucemia mieloide crónica BCR-ABL es una tirosin quinasa funcional autónoma Proloferación irregular Imatinib se une a los sitios ATP y evita la fosforilación de la proteína

22 CONSTITUCION CROMOSOMICA NORMAL

23 Paciente femenina de 64 años con Dx. de LMC Primera muestra

24 Paciente femenina de 64 años con Dx. de LMC Primera muestra 46,XX,t(9:22)(q34;q11.2 [14]/ Hiperdiploidía mayor de 90 cromosomas [6]

25 Importancia de los estudios Utilidad del análisis cromosómico convencional para el desarrollo de nuevos Tx antineoplásicos. Citogenética molecular (FISH) permite la ID de rearreglos genómicos que ayuda al desarrollo de nuevos medicamentos.

26 Selected Examples of Chromosomal Rearrangements

27 Genes de Factores de Transcripci ó n Los rearreglos cromosómicos que alteran los genes de F. de T dan por resultado: Proteínas de fusión con actividad transcripcional aberrante o aumentada. En LMA La proteína quimérica PML-RARA Proteínas de fusión que median la represión transcripcional.

28 Genes de Factores de Transcripci ó n Chromosomal rearrangements that entail aberrant transcriptional repression occur in a substantial proportion of patients with acute myeloid leukemia.38 For example, the chimeric proteins resulting from fusion genes such as PML-RARA

29 Las prote í nas de fusi ó n asociadas a represi ó n transcripcional son blanco Tx. El á cido retin ó ico y el tri ó xido de ars é nico revierten la represi ó n transcripcional causada por la prote í na de fusi ó n PML-RARA Ambos medicamentos son efectivos en el Tx de leucema promieloc í tica.

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31 Cytogenetic Abnormalities Leading to the Expression of Deregulated Tyrosine Kinases in Chronic Myeloproliferative Disorders

32 Estudio citogenético Citogenética Molecular: FISH

33 Citogenética/ Molecular Ha permitido la ID de la fusi ó n del gen ABL1 al gen NUP214 en la banda 9q34. Presente en el 5% de adultos con Leucemia linfobl á stica aguda de c é lulas T Sensible a Imatinib La fusi ó n es episomal. (elementos extracroms ó micos no detectables por an á lisis citogen é tico convencional.

34 Desequilibrios Cromosómicos Pueden ser por ganancia o pérdida de material genético: Las ganancias genómicas incluyen: Trisomías: parciales o incompletas Amplificaciones Intracromosómicas (regiones homogéneamente teñidas sin patrones de bandeo) Extracromosómicas (cromosomas double-minute, ADN autónomo, acéntrico de tamaño variable).

35 Desequilibrios Cromosómicos. Las pérdidas genómicas incluyen: Monosomías Deleciones Grandes Sub-microscópicas La causa de anomalías cromosómicas no es conocida. Estudios en varios tipos de leucemias han demostrado que exposiciones ambientales y ocupacionales y Tx con medicamentos citotóxicos pueden inducir aberraciones cromosómicas.

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37 Utilidad de los marcadores citogen é ticos. Diagnóstico: Anormalidades cromosómicas asociadas a ciertos tipos de leucemias Respuesta al tratamiento: Rearreglos cromosómicos como el gen fusión BCR-ABL1 son indicadores sensibles en la evaluación de la evolución del cáncer.

38 Aplicaciones El an á lisis de las anormalidades cromos ó micas se puede utilizar para identificar sub-poblaciones de pacientes con un mayor beneficio de un Tx particular.

39 Desregulaci ó n de expresi ó n Los rearreglos que se yuxtaponen a elementos regulatorios tejido espec í ficos (genes promotores o secuencias aumentadoras) en la secuencia codificante de un proto-oncogen desregulan su expresi ó n.

40 Desequilibrios cromos ó micos Pueden ser: Alteraciones en todo el gen Duplicaciones o deleciones intrag é nicas A diferencia de los rearreglos, las consecuencias funcionales de los desequilibrios no se conocen. Las consecuencias de los rearreglos pueden ser identificados por sus sitios de ruptura.

41 Técnicas de estudio Desequilibrio de regiones cromosómicas grandes contienen muchos genes. Tumores presentan anomalías cr desbalanceadas La integración de estudios genómcios completos, perfil de expresión génica, técnicas de genómica funcional permiten la id de genes importantes dentro de regiones genómicas afectadas por anomalías cromosómicas.

42 Ganancias gen ó micas Contribuyen a la genesis del c á ncer Incrementan la actividad de genes especi çí ficos en las regiones cromos ó micas afectadas. Algunos genes codifican para prote í nas que pueden ser blanco de nuevos esquemas terap é uticos. 30% de las mujeres con Ca de mama presentan amplificaci ó n del gen ERBB2 (receptor de tirosisn cinasa) ubicado en la banda 17q21.1 Esta mol é cula es blanco del trastuzumab, anticuerpo monoclonal utilizado en el Tx.

43 Ganancias gen ó micas a gran escala Aparecen por no disyunci ó n o por traslocaciones desbalanceadas, generando trisom í as compleats o parciales, por eventos de amlificaci ó n afctando segmentos de DNA de tama ñ o diverso Ha permitido descubrir nuevos oncogenes.

44 Pérdidas genómicas a gran escala Deleciones extensas afectan m ú ltiples genes. Se dificulta Id cual p é rdida g é nica se asocia al desarrollo de la neoplasia Genes candidatos de dichas regiones son analizados para deleciones, mutaciones, o modificaciones epigen é ticas que inactivan el alelo restante.

45 Ganancias focales Variaciones en el n ú mero de copias se han identificado por tamizaje de genomas tumorales. M é todos de alta resoluci ó n Hibridaci ó n gen ó mica comparativa (CGH) Polimorfimos de un solo nucle ó tido (SNP) Arreglos de CGH y de SNP

46 P é rdidas gen ó micas Van desde alteraciones visibles por citogen é tica (monosom í as parciales o completas) hasta deleciones intrag é nicas o de un solo gen. Su contribuci ó n a la transformaci ó n maligna puede ser por la reducci ó n de la funci ó n de genes espec í ficos en las regiones cromos ó micas afectadas. Las t é cnicas gen ó micas modernas han permitido la identificaci ó n de nuevos genes supresores tumorales que act ú an a trav é s de insuficiecia al é lica y el descubrimiento de genes no codificantes

47 Pérdidas genómicas Deleciones con valor pron ó stico y decisi ó n Tx. del(5q) en LMA del(11q), del(13q), y del (17p) en LLC

48 Arreglos de SNP Ú tiles en el descubriemiento de genes asociados a p é rdidas gen ó micas. Aprox. 30% de ni ñ os con LLA (c é lulas B) del (9p13) PAX5 M á s del 80% de pacientes con LLA BCR- ABL positivos del(7p13-p11.1) IKZF1

49 P é rdidas gen ó micas con insuficiencia al é lica Se utiliza el RNA de interferencia ID de gen causal de s í ndrome mielodispl á sico (5q menos) RPS14. P é rdida de 1.5-Mb en 5q32. Estos pacientes responden muy bien a un derivado de talidomida (lenalidomide).

50 P é rdidas gen ó micas de genes no codificantes P é rdidas cromos ó micas asociadas a c á ncer que act ú an mediante la inactivaci ó n de genes no codificantes de prote í nas Contienen genes de microRNAs asociados a regulaci ó n pos transcripcional de la expresi ó n g é nica. Micro RNAs con actividad suresora tumoral.

51 P é rdidas gen ó micas de genes no codificantes 50% de los pacientes con LLC tienen deleci ó n de un segmento en 13q14.3. Este contiene los genes MIRN15A y MIRN16-1 Los genes MIRN15A y MIRN16-1 regulan negativamente la expresi ó n de la prote í na BCL2.93 (apopt ó tica).

52 Proteína quimérica aberrante Los rearreglos que dan lugar a la expresión de una proteína quimérica con actividad aberrantemente aumentada están representados por la traslocación t(11;22)(q24.1-q24.3;q12.2) asociada al sarcoma de Ewing

53 Prónostico Transplante de c é lulas madre es importante en el Tx de LMA. Se debe evitar si se tiene un patr ó n citogen é tico asociad a buen pron ó stico Traslocaciones: t(8;21) y t(16:16) Inversiones: inv(16) Se debe considerar el transplante en pacientes con anomal í as citogen é ticas asociadas a reca í das despu é s de quimioterapia.

54 Pronóstico Genotipos de bajo riesgo, asociados a reca í da en el 35% de los casos, en pacientes con citogen é tico normal. Presencia de mutaciones favorables Gen del F. de T. CEBPA Gen de nucleofosomina (NPM1) Ausencia de duplicaciones en tandem internas desfavorables en el gen tirocin cinasa 3 asociado a fms (FLT3-ITD).

55 Micro RNAs en LMA Los microRNA son peque ó s segmentos de RNA de una sola cadena (19-25 nucle ó tidos). Hay estudios que muestran perfiles de expresi ó n de microRNAs caracter í sticos en sub tipos de LMA citogen é tica y molecularmente definidos. Los perfiles de expresi ó n de microRNAs tienen valor pron ó stico independiente de la influencia de la mutaci ó n de FLT3-ITD.

56 MicroRNAs Hay un grupo de 12 secencias de microRNAs que distinguen 2 subgrupos de LMA citogen é ticamente normal. Uno con probabilidad de sobrevida libre de enfermedad de 11% y otro con 36% de probabilidad. LMA con genotipo FLT3-ITD y NPM1 silvestre y ausencia de FLT3-ITD. Ambos fenotipos comstituyen el 60% de los casos de LMA.

57 Pui C et al. N Engl J Med 2004;350: Estimated Frequency of Specific Genotypes of ALL in Children and Adults

58 Lowenberg B et al. N Engl J Med 1999;341: The AML1-CBF{beta} Transcription Factor

59 Desequilibrio cromosómico Leucemia mieloide aguda amp(13) (q12.3) CDX2 amp(21)(q22.3) ERG del(5q)? del(7q)? del(20q)? del(12)(p13) EPV6 Leucemia mielocítica crónica del(7)(p13-p11.1) fase blástica Leucemia linfoblástica aguda del(12)(p13) EPV6 del(7)(p13-p11.1) (BCR/ABL1 pos)

60 Dohner H et al. N Engl J Med 2000;343: Probability of Survival from the Date of Diagnosis among the Patients in the Five Genetic Categories

61 Perfiles de expresió Gene-expression profiling is a genomics technique that has proved effective in deciphering this biologic and clinical diversity. The approach relies on the fact that only a

62 CGH

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64 Examples of Chromosome Banding, Interphase Fluorescence in Situ Hybridization, Spectral Karyotyping, and Array-Based Comparative Genomic Hybridization

65 Because we know more specific information, we can… Diagnose more precisely Provide more effective treatment. Select specific treatment that best fits disease Target the medication to the disorder. Avoid adverse drug reactions. Avoid delay from false starts. Predict risk before symptoms occur Provide earlier treatment. Take preventive action. Manage disease more effectively Eliminate unnecessary treatment. Provide better timing. Adjust treatment as disease changes. AND…

66 LLA es la más común en niños. Las pruebas genéticas permiten la ID de subtipos y permiten la admon. De Tx específicos Actulmente la tasa de curación es mayor del 80% contra 4% en los años 60s. Impacto de las pruebas genéticas y Tx basados en el genoma en la sobrevida de niños con leucemia Source: New England Journal of Medicine, 2006, 200l; Personalized Medicine Coalition, Diagnóstico Las pruebas genéticas que ID mutaciones del DNA en leucemias infantiles permiten la selección de tratamientos más específicos

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70 Courtesy of Signature Genomics Comparative Genomic Hybridization

71 Selección de Tx específicos La traslocación 9; 22 que da por resultado el gen fusión de BCR/ABL se conoce como Cromosoma Filadelfia el cual es carácterístico de la Leucemia mieloide aguda.

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74 Today, Cancer is experiencing a shift toward precision medicine Disease of the blood 2 types: leukemia & lymphoma Farber develops 1 st chemotherapy for leukemia 3 types of leukemia (acute, chronic, preleukemia) and 2 types of lymphoma (indolent, aggressive) Novartis launches Gleevec, the 1 st molecular targeted drug, to treat myeloid leukemia 38 types of leukemia; 51 types of lymphoma Source: Mara Aspinall, Genzyme

75 Genetic tests identify variations in the BRCA 1 and BRCA 2 genes that increase risks for breast and ovarian cancer. Genetic tests identify greatly increased hereditary risk for breast and ovarian cancer Knowledge of increased risk allows preventive measures, such as closer monitoring, risk avoidance, and preventive surgery or chemotherapy Predict Risk of Disease Before Symptoms … with BRCA 1 and 2 = 50% - 85% ….without = 13% Lifetime risk of developing breast cancer… Lifetime risk of developing ovarian cancer… …with BRCA 1 and 2 = 10% - 45% … without = 1.7%

76 Molecular diagnostics is at the core of the personalized medicine vision Diseases will be diagnosed long before the patient begins to manifest any evidence using traditional tools In vitro Laboratory Tests In vivo Imaging Techniques Signs & Symptoms Molecular Diagnostics


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