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Período 2001-2007 Caracterización funcional del dominio de unión a calmodulina de Trk: estudio de su papel en la regulación de las vias de señalización.

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1 Período Caracterización funcional del dominio de unión a calmodulina de Trk: estudio de su papel en la regulación de las vias de señalización. Ministerio de Sanidad y Consumo, PI042537, IP: Marta Llovera Tomas Proyecto 2

2 YRKF Posible motivo de tráfico Yxx (Jullien et al 2002) Posible diana de fosforilación Período Búsqueda del dominio de interacción de TrkA con CaM Mutantes del YRKF Y701F: altera Yxx, no fosforilable Y701D: altera Yxx, mimetiza fosforilación

3 Marsh & McMahon, 1999 Rol de Y701 en la interacción del receptor con clatrina Período Función de Y701 en la internalización de TrkA La Y701 participa en la internalización de Trk mediada por clatrina

4 Relevancia de Y701 en la actividad biológica de TrkA Período La Y701 es importante para la diferenciación mediada por TrkA

5 Caracterización de la actividad de los mutantes de la Y701 Efecto de la mutación en la activación de vías Actividad in vitro del receptor Período Y701 es importante para la actividad del receptor Trk inducida por NGF

6 de Pablo Y, Pérez-García MJ, Georgieva MV, Sanchis D, Lindqvist N, Soler RM, Comella JX, Llovera M. Tyr-701 is a new relevant site for neurotrophin receptor TrkA internalization and function. J Neurochem. En prensa (JNC-E R2) Publicaciones proyecto 2 Período

7 Yolanda de Pablo Maya Georgieva Maria José Pérez-García Christian Nake Joaquin Egea Mario Encinas Judit Herreros Rosa M Soler Tatché Daniel Sanchis Joan X Comella Grupo de Señalización Celular y Apoptosis Ciències Mèdiques Bàsiques Universitat de Lleida Elia Benito, UB Jordi García, UB Soporte técnico Isabel Sanchez Roser Pané Rosa Gomez D. Martín-Zanca (CSIC-USAL) Natividad Rocamora (ICO) Colaboradores Eduardo Soriano (PCB) Uwe Drescher (Kings College,UK)

8 Resumen índices bibliométricos Total de artículos publicados37 Artículos en posición relevante27 Índice de impacto Promedio4,2 Índice de citas acumulado1172 Índice de citas promedio31,7 Artículo como primer autor más citado104 Factor H20 Postdoctoral El mutante de la prolactina G129R actúa como un antagonista en líneas celulares de cáncer de mama. Estrategias encaminadas a incrementar su afinidad por el receptor lo convertirán en un potencial tratamiento contra el cáncer de mama. Predoctoral Implicación del TNF y el sistema proteolítico dependiente de ATP/Ub en la degradación proteica muscular asociada a la caquexia cancerosa. Postdoctoral En macrófagos activados, la nitración de proteínas en residuos Tyr interfiere con las vías de señalización del IFN, debido al bloqueo de los sitios de fosforilación. Postdoctoral Calmodulina se une al extremo C-terminal del receptor de neurotrofinas TrkA de forma directa y dependiente de calcio. El motivo YRKF de TrkA participa en la endocitosis dependiente de clatrina y la Y701 es importante para la actividad del receptor Trk. Etapas PeríodoAportaciones

9 Proyecto de investigación 1. Estudio de la implicación del extremo C-terminal de TrkA en la interacción con CaM y de su relevancia en la señalización por TrkA 2. Caracterización de la fosforilación de la Ser671 de TrkA Caracterización de dos regiones del dominio intracelular de TrkA

10 Proyecto de investigación 1. Estudio de la implicación del extremo C-terminal de TrkA en la interacción con CaM y de su relevancia en la señalización por TrkA 2. Caracterización de la fosforilación de la Ser671 de TrkA Caracterización de dos regiones del dominio intracelular de TrkA

11 Unión de CaM en la región de TrkA (Llovera et al 2004) Unión de CaM en la región de TrkA (Llovera et al 2004) Delimitar de manera más precisa la región de unión a CaM Delimitar de manera más precisa la región de unión a CaM GST-TrkAi GST-TrkAi

12 ? ? CaM Identificación de una región candidata para la unión de calmodulina

13 Hipótesis de trabajo Objetivos VLLV 1.Determinar si el dominio VHARLQALAQAPPV constituye el sitio de interacción con CaM 2.Caracterizar la importancia de estos residuos en la señalización iniciada por TrkA 3.Analizar si la mutación en este motivo afecta la interacción con las proteínas de unión al extremo COOH-terminal de TrkA: PLC, la ligasa de ubiquitina Nedd4-2 y Csk homologous kinase Los aminoácidos hidrofóbicos del extremo COOH-terminal de Trk conforman un motivo 1-14 de unión a CaM que es relevante para la señalización por TrkA: VLLV secuencia VHARLQALAQAPPV Estudio de la implicación del extremo C-terminal de TrkA en la interacción con CaM y de su relevancia en la señalización por TrkA

14 Generación de mutantes de los residuos L778 y V784 VLLV VHARLQALAQAPPV VLAV VHARLQAAAQAPPV VLAA VHARLQAAAQAPPA TrkAwt L778A L778A/V784A Ensayos bioquímicos: Test de la interacción de TrkA (C-teminal) con CaM Ensayos en células PC12nnr5: Analizar la activación de TrkA (autofosforilación, activación de cascadas de señalización, diferenciación, supervivencia) Verificar la interacción y activación de proteínas que se unen al COOH-terminal (PLC-, CHK, Nedd4-2) GST- Y785 Metodología

15 Proyecto de investigación 1. Estudio de la implicación del extremo C-terminal de TrkA en la interacción con CaM y de su relevancia en la señalización por TrkA 2. Caracterización de la fosforilación de la Ser671 de TrkA Caracterización de dos regiones del dominio intracelular de TrkA

16 Prof Ole N Jensen Elisabetta Boeri-Erba Anne J. Kleinnijenhuis Protein Research Group Dep. of Biochemistry and Molecular Biology University of Southern Denmark Odense M, Denmark. PO 4 DIYSTDYYR y8y8 y7y7 y6y6 y5y5 y4y4 y3y3 y2y2 y1y1 m= 80 Da m/z Intensity

17 InactiveActive Ser671 Tyr674 Tyr675 Tyr674 Tyr675 catalytic site Lys538

18 Hipótesis de trabajo Objetivos La fosforilación de TrkA en Ser671 juega un papel importante en la regulación de la activación del receptor 1.Generar anticuerpos fosfoespecíficos contra TrkA fosforilado en Ser671 y sobre la forma triplemente fosforilada en el loop de activación: S671/Y674/Y Analizar la relevancia de la Ser671 en la activación de TrkA 3.Estudiar si esta Ser es también sitio de fosforilación en TrkB y TrkC 4.Averiguar qué Ser/Thr kinasa o kinasas son las responsables de esta fosforilación. 5.Caracterizar la cinética de esta fosforilación en células PC12 y en cultivos primarios de neuronas 2. Caracterización de la fosforilación de la Ser671 de TrkA

19 Obtención de anticuerpos fosfoespecíficos: Dr Thorsten Wiederhold de Cell Signaling Technology Obtención de anticuerpos fosfoespecíficos: Dr Thorsten Wiederhold de Cell Signaling Technology Caracterización de la cinética de fosforilación en Ser671 Caracterización de la cinética de fosforilación en Ser671 Análisis de las vías de señalización implicadas mediante el uso de inhibidores específicos (ej. PD98059 o U0126 para MEK1/2, wortmanin o LY para PI 3-kinasa…) Análisis de las vías de señalización implicadas mediante el uso de inhibidores específicos (ej. PD98059 o U0126 para MEK1/2, wortmanin o LY para PI 3-kinasa…) Detección de fosforilación en el residuo equivalente en TrkB y TrkC en sobreexpresión y en cultivos primarios de neuronas corticales Detección de fosforilación en el residuo equivalente en TrkB y TrkC en sobreexpresión y en cultivos primarios de neuronas corticales Generación de los mutantes puntuales de Ser671 : Generación de los mutantes puntuales de Ser671 : S671A: mutante no fosforilable en Ser671 S671D: mutante que mimetiza la fosforilación en S671 Estudiar la actividad de estos mutantes en células PC12nnr5 transfectadas con los plásmidos de expresión Estudiar la actividad de estos mutantes en células PC12nnr5 transfectadas con los plásmidos de expresión autofosforilación inducida por NGFautofosforilación inducida por NGF activación de vías de señalizaciónactivación de vías de señalización capacidad de transmitir el señal de diferenciación y supervivenciacapacidad de transmitir el señal de diferenciación y supervivencia Identificación de la kinasa implicada Identificación de la kinasa implicada Metodología

20 Web site: 1.Yu Xue, Fengfeng Zhou, Minjie Zhu, Guoliang Chen, and Xuebiao Yao, GPS: a comprehensive www server for phosphorylation sites prediction. Nucleic Acids Res. 33: W184-7GPS: a comprehensive www server for phosphorylation sites prediction. 2.Fengfeng Zhou, Yu Xue, Guoliang Chen, and Xuebiao Yao, GPS: a novel group-based phosphorylation predicting and scoring method. Biochem Biophys Res Commun. 325(4): GPS: a novel group-based phosphorylation predicting and scoring method. PositionPeptideKinase GPS Score Cutoff Score 671DIYSTDYIPL1(yeast)7,5005,0 671DIYSTDYPKB8,0003,2 671DIYSTDYS6K6,0005,8 ¿Qué kinasa fosforila TrkA en Ser671? Baker & McKinnon, 2004

21 Ensayos kinasa in vitro con kinasas activas comerciales (PKB, S6K…) RDIYSTDYYRVGGR Péptidos: HHHHHHGGGRDIYSTDYYRVGGRRR RDIYATDYYRVGGR HHHHHHGGGRDIYATDYYRVGGRRR GST-TrkAiwt y GST-TrkAi-S671A In-gel kinase assay Arrays de kinasas comerciales Una vez identificada la kinasa: Interacción kinasa-sustrato (co-IP o cross-linking ) ¿Qué kinasa fosforila TrkA en Ser671?

22 Y785 Shc PLC TrkA Y490 P NGF P P Y785 P SurvivalDifferentiation FRS-2 endosome Rap-1 DAG IP 3 B-Raf C3G PKC ER Ca 2+ Grb-2 SOS Raf-1 Shc Grb-2 Gab1 PI3K MEK1/2 ERK1/2 Ras PDK1 mTOR Akt S6K ¿Fosforilación basal o regulación por feed-back?

23 Mass spectrometry analysis Prof Ole N Jensen Dr Elisabetta Boeri-Erba Dr Anne J. Kleinnijenhuis Colaboradores Phospho-specific antibody production Dr Thorsten Wiederhold

24 AsignaturaCicloCursoCuatr.CarácterCréditos Biologia Celular112ºTroncal6 Cultivos Celulares232ºTroncal4,5 Biología CelularBiotecnología Contenidos de Biología Celular en la licenciatura de Biotecnología PROYECTO DOCENTE

25 Conocimiento de las técnicas básicas de manipulación de las células en cultivo y sus aplicaciones en el campo de la biotecnología. 1.Conocer los principales tipos de cultivos celulares y de tejidos tanto vegetales como animales. 2.Conocer los métodos de introducción de ADN exógeno en células en cultivo y saber cómo determinar qué método es el más adecuado. 3.Conocer las principales aplicaciones del cultivo de células y tejidos tanto vegetales como animales. OBJETIVOS FORMATIVOS Objetivo global: Objetivos específicos: Cultivos celulares

26 4.Ser capaz de leer, entender y comunicar los resultados de un artículo científico sobre cultivos celulares. 5.Ser capaz de iniciar un cultivo de células y de tejidos vegetales. 6.Ser capaz de diseñar un medio nutritivo para el cultivo de células y tejidos vegetales. 7.Ser capaz de descongelar y mantener en cultivo una línea celular de mamífero. 8.Ser capaz de transfectar células en cultivo y de optimizar el protocolo de transfección para una línea celular determinada. Objetivos específicos: Cultivos celulares

27 Tipo actividad Descripción resumida de la actividadDedicación (horas) Objectivo formativo TEOTema 1. Introducción y técnicas11 TEOTema 2. Características y técnicas básicas de los cultivos vegetales 11 TEOTema 3. Cultivos de órganos o fragmentos vegetales31 TEOTema 4. Cultivo de células vegetales21 TEOTema 5. Cultivos vegetales y transformación de plantas22 TEOTema 6. Aplicaciones de los cultivos in vitro vegetales13 TEOTema 7. Técnicas de manipulación de células animales en cultivo. 21 TEOTema 8. Cultivos celulares especializados y técnicas asociadas. 21 TEOTema 9. Sistemas de modificación celular.22 TEOTema 10. Biotecnología de tejidos.23 TEOTema 11. Biotecnología en células animales.23 Temario teórico Cultivos celulares

28 Temario práctico Tipo actividad Descripción resumida de la actividadDedicación (horas) Objetivo formativo PRAPrácticas 1-3: Diseño de una unidad de cultivo de células y tejidos vegetales. Elaboración y preparación de medios de cultivo. Iniciación de un cultivo de tejidos vegetales 85-6 PRAPráctica 4: Organogénesis y regeneración25-6 PRAPrácticas 5-7: Descongelación y puesta en cultivo de una línea celular. Ensayo de citotoxicidad. Transfección de células con PEI: optimización del protocolo. Congelación de células PROEstudio de casos: cultivos vegetales14 PROEstudio de casos: cultivos animales14 SEMSeminario: introducción y presentación14 SEMSeminario: exposición y planteamiento de preguntas24 Cultivos celulares

29 BIBLIOGRAFIA COLLIN HA, EDWARDS S Plant cell culture. Bios Scientific Publishers. GAMBORG OL, PHILLIPS GC Plant cell tissue and organ culture. Fundamental methods. Springer Verlag. TAJI A, KUMAR PP, LAKSHAMANAN P In vitro plant breeding. Food Products Press ALBERTS B, JOHNSON A, LEWIS J, RAFF M, ROBERTS K, WALTER P Biología Molecular de la Célula, 4ª edición. Editorial Omega, Barcelona. FRESHNEY RI Culture of animal cells. John Wiley & Sons. Ltd. SPECTOR DL, GOLDMAN RD, LEINWAND LA Cells: A Laboratory Manual. New York Cold Spring Harbor Laboratory Press cop. Cultivos celulares Bibliografía básica:

30 GEORGE EF. Plant propagation by tissue culture. Part 1 (1993): The technology. 574p. Part 2 (1996): In practice. 799p. Exegetics Ltd., England. ENDRESS R Plants cell biotechnology. Springer Verlag. TRIGIANO RN, GRAY DJ. (Eds) Plant tissue culture concepts and laboratory exercises- CRC Press. Razdan M.K Introduction to plant tissue culture. Intercept. UK. LODISH H, BERK A, MATSUDAIRA P, KAISER CA, KRIEGER M, SCOUT MP, ZIPURSKY SL, DARNELL J Molecular Cell Biology, 5th edition. WH Freeman and Co., New York. (PubMed) KARP G Cell and Molecular Biology. Concepts and Experiments. 3rd Edition. John Wiley & Sons. Inc. New York BONIFACINO JS, DASSO M, LIPPINCOTT-SCHWARTZ J, HARFORD JB, YAMADA KM Current Protocols in Cell Biology. John Wiley & Sons. Ltd. WILSON L, MATSUDAIRA P. Methods in Cell Biology (series). Academic Press. MORGAN JR., YARMUSH ML Tissue engineering. Humana press. Cultivos celulares Bibliografía complementaria:

31 The virtual library of Cell Biology: Lecture 15 - Gene Expression in Cultured Cells (Prof Roger L. Miesfeld) tml tml ECACC Handbook: Resources/ECACC_Handbook/Cell_Culture_Techniques_12.html Resources/ECACC_Handbook/Cell_Culture_Techniques_12.html Tissue culture Methods: Otras fuentes de información Cultivos celulares

32 Clases teóricas: en las que los alumnos adquieren los conceptos básicos de la asignatura. Diapositivas PowerPoint Material disponible en la web de la UdL (dossiers electrónicos) Pizarra Análisis de casos: resolución de casos prácticos para la aplicación de los conceptos teóricos a situaciones reales Caso real expuesto por el profesor a resolver entre todos. Seminarios: lectura, comprensión y exposición oral de los resultados de un artículo científico sobre cutivos celulares. Ayudarán a fomentar el espíritu crítico y la expresión oral. Artículo científico a trabajar en grupos de 3 personas Prácticas de laboratorio: las prácticas permiten la consolidación de los conceptos teóricos adquiridos y enseña las bases para el trabajo en un laboratorio de cultivos. Manipulación individualizada de células en cultivo (grupos de 5 personas) Metodología Cultivos celulares

33 conocimientos,aptitudes y habilidades Se valorará la adquisión de conocimientos, aptitudes y habilidades mediante: Examen escrito tipo test sobre la teoría y análisis de casos Valoración de la exposición oral del seminario Valoración del cuaderno de laboratorio de prácticas La nota final será: 70% conocimientos teóricos 15% seminario 15% cuaderno de prácticas Evaluación Cultivos celulares


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