Período Ciències Mèdiques Bàsiques Universitat de Lleida

Presentación del tema: "Período Ciències Mèdiques Bàsiques Universitat de Lleida"— Transcripción de la presentación:

1 Período 2001-2007 Ciències Mèdiques Bàsiques Universitat de Lleida
Caracterización funcional del dominio de unión a calmodulina de Trk: estudio de su papel en la regulación de las vias de señalización. Ministerio de Sanidad y Consumo, PI042537, IP: Marta Llovera Tomas Proyecto 2

2 Período 2001-2007 Búsqueda del dominio de interacción de TrkA con CaM
Ciències Mèdiques Bàsiques Universitat de Lleida Búsqueda del dominio de interacción de TrkA con CaM YRKF Posible motivo de tráfico Yxx (Jullien et al 2002) Posible diana de fosforilación Mutantes del YRKF Y701F: altera Yxx, no fosforilable Y701D: altera Yxx, mimetiza fosforilación

3 Período 2001-2007 Ciències Mèdiques Bàsiques Universitat de Lleida
Función de Y701 en la internalización de TrkA Rol de Y701 en la interacción del receptor con clatrina Marsh & McMahon, 1999 La Y701 participa en la internalización de Trk mediada por clatrina

4 Período 2001-2007 Ciències Mèdiques Bàsiques Universitat de Lleida
Relevancia de Y701 en la actividad biológica de TrkA La Y701 es importante para la diferenciación mediada por TrkA

5 Período Ciències Mèdiques Bàsiques Universitat de Lleida Caracterización de la actividad de los mutantes de la Y701 Efecto de la mutación en la activación de vías Actividad in vitro del receptor Y701 es importante para la actividad del receptor Trk inducida por NGF

6 Período 2001-2007 Ciències Mèdiques Bàsiques Universitat de Lleida
de Pablo Y, Pérez-García MJ , Georgieva MV, Sanchis D, Lindqvist N, Soler RM, Comella JX, Llovera M. Tyr-701 is a new relevant site for neurotrophin receptor TrkA internalization and function. J Neurochem. En prensa (JNC-E R2) Publicaciones proyecto 2

7 Grupo de Señalización Celular y Apoptosis Ciències Mèdiques Bàsiques
Período Ciències Mèdiques Bàsiques Universitat de Lleida Colaboradores Yolanda de Pablo Maya Georgieva Maria José Pérez-García Christian Nake Joaquin Egea Mario Encinas Judit Herreros Rosa M Soler Tatché Daniel Sanchis Joan X Comella Soporte técnico Isabel Sanchez Roser Pané Rosa Gomez D. Martín-Zanca (CSIC-USAL) Natividad Rocamora (ICO) Eduardo Soriano (PCB) Uwe Drescher (King’s College,UK) Elia Benito, UB Jordi García, UB Grupo de Señalización Celular y Apoptosis Ciències Mèdiques Bàsiques Universitat de Lleida

8 Resumen índices bibliométricos
Etapas Período Aportaciones Predoctoral Implicación del TNF y el sistema proteolítico dependiente de ATP/Ub en la degradación proteica muscular asociada a la caquexia cancerosa. Postdoctoral En macrófagos activados, la nitración de proteínas en residuos Tyr interfiere con las vías de señalización del IFN, debido al bloqueo de los sitios de fosforilación. Postdoctoral El mutante de la prolactina G129R actúa como un antagonista en líneas celulares de cáncer de mama. Estrategias encaminadas a incrementar su afinidad por el receptor lo convertirán en un potencial tratamiento contra el cáncer de mama. Postdoctoral Calmodulina se une al extremo C-terminal del receptor de neurotrofinas TrkA de forma directa y dependiente de calcio. El motivo YRKF de TrkA participa en la endocitosis dependiente de clatrina y la Y701 es importante para la actividad del receptor Trk. 73% dels articles estic en una posició relevant (1r, 2n o corresponding) Resumen índices bibliométricos Total de artículos publicados 37 Artículos en posición relevante 27 Índice de impacto Promedio 4,2 Índice de citas acumulado 1172 Índice de citas promedio 31,7 Artículo como primer autor más citado 104 Factor H 20

9 Caracterización de dos regiones del dominio intracelular de TrkA
Proyecto de investigación Caracterización de dos regiones del dominio intracelular de TrkA 1. Estudio de la implicación del extremo C-terminal de TrkA en la interacción con CaM y de su relevancia en la señalización por TrkA 2. Caracterización de la fosforilación de la Ser671 de TrkA

10 Caracterización de dos regiones del dominio intracelular de TrkA
Proyecto de investigación Caracterización de dos regiones del dominio intracelular de TrkA 1. Estudio de la implicación del extremo C-terminal de TrkA en la interacción con CaM y de su relevancia en la señalización por TrkA 2. Caracterización de la fosforilación de la Ser671 de TrkA

11 Unión de CaM en la región 668-790 de TrkA (Llovera et al 2004)
Delimitar de manera más precisa la región de unión a CaM GST-TrkAi GST-TrkAi 

12 Identificación de una región candidata para la unión de calmodulina
? CaM

13 Hipótesis de trabajo Objetivos
Estudio de la implicación del extremo C-terminal de TrkA en la interacción con CaM y de su relevancia en la señalización por TrkA Hipótesis de trabajo Los aminoácidos hidrofóbicos del extremo COOH-terminal de Trk conforman un motivo 1-14 de unión a CaM que es relevante para la señalización por TrkA: secuencia VHARLQALAQAPPV Objetivos Determinar si el dominio VHARLQALAQAPPV constituye el sitio de interacción con CaM Caracterizar la importancia de estos residuos en la señalización iniciada por TrkA Analizar si la mutación en este motivo afecta la interacción con las proteínas de unión al extremo COOH-terminal de TrkA: PLC, la ligasa de ubiquitina Nedd4-2 y Csk homologous kinase

14 GST- Metodología Generación de mutantes de los residuos L778 y V784
VHARLQALAQAPPV VHARLQAAAQAPPV VHARLQAAAQAPPA TrkAwt L778A L778A/V784A GST- Y785 Ensayos bioquímicos: Test de la interacción de TrkA (C-teminal) con CaM Ensayos en células PC12nnr5: Analizar la activación de TrkA (autofosforilación, activación de cascadas de señalización, diferenciación, supervivencia) Verificar la interacción y activación de proteínas que se unen al COOH-terminal (PLC-, CHK, Nedd4-2)

15 Caracterización de dos regiones del dominio intracelular de TrkA
Proyecto de investigación Caracterización de dos regiones del dominio intracelular de TrkA 1. Estudio de la implicación del extremo C-terminal de TrkA en la interacción con CaM y de su relevancia en la señalización por TrkA 2. Caracterización de la fosforilación de la Ser671 de TrkA

16 Elisabetta Boeri-Erba Anne J. Kleinnijenhuis
Prof Ole N Jensen Elisabetta Boeri-Erba Anne J. Kleinnijenhuis Protein Research Group Dep. of Biochemistry and Molecular Biology University of Southern Denmark Odense M, Denmark. PO4 D I Y S T R y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1 m= 80 Da m/z Intensity 

17 Inactive Active Ser671 Ser671 Tyr674 Tyr675 Tyr674 Tyr675 Lys538
catalytic site Tyr674 Tyr675 Tyr674 Tyr675

18 2. Caracterización de la fosforilación de la Ser671 de TrkA
Hipótesis de trabajo La fosforilación de TrkA en Ser671 juega un papel importante en la regulación de la activación del receptor Objetivos Generar anticuerpos fosfoespecíficos contra TrkA fosforilado en Ser671 y sobre la forma triplemente fosforilada en el loop de activación: S671/Y674/Y675. Analizar la relevancia de la Ser671 en la activación de TrkA Estudiar si esta Ser es también sitio de fosforilación en TrkB y TrkC Averiguar qué Ser/Thr kinasa o kinasas son las responsables de esta fosforilación. Caracterizar la cinética de esta fosforilación en células PC12 y en cultivos primarios de neuronas

19 Metodología Obtención de anticuerpos fosfoespecíficos: Dr Thorsten Wiederhold de Cell Signaling Technology Caracterización de la cinética de fosforilación en Ser671 Análisis de las vías de señalización implicadas mediante el uso de inhibidores específicos (ej. PD98059 o U0126 para MEK1/2, wortmanin o LY para PI 3-kinasa…) Detección de fosforilación en el residuo equivalente en TrkB y TrkC en sobreexpresión y en cultivos primarios de neuronas corticales Generación de los mutantes puntuales de Ser671 : S671A: mutante no fosforilable en Ser671 S671D: mutante que mimetiza la fosforilación en S671 Estudiar la actividad de estos mutantes en células PC12nnr5 transfectadas con los plásmidos de expresión autofosforilación inducida por NGF activación de vías de señalización capacidad de transmitir el señal de diferenciación y supervivencia Identificación de la kinasa implicada

20 ¿Qué kinasa fosforila TrkA en Ser671?
Baker & McKinnon, 2004 Position Peptide Kinase GPS Score Cutoff Score 671 DIYSTDY IPL1(yeast) 7,500 5,0 PKB 8,000 3,2 S6K 6,000 5,8 Yu Xue, Fengfeng Zhou, Minjie Zhu, Guoliang Chen, and Xuebiao Yao, GPS: a comprehensive www server for phosphorylation sites prediction. Nucleic Acids Res. 33: W184-7 Fengfeng Zhou, Yu Xue, Guoliang Chen, and Xuebiao Yao, GPS: a novel group-based phosphorylation predicting and scoring method. Biochem Biophys Res Commun. 325(4): Web site:

21 ¿Qué kinasa fosforila TrkA en Ser671?
Ensayos kinasa in vitro con kinasas activas comerciales (PKB, S6K…) Péptidos: HHHHHHGGGRDIYSTDYYRVGGRRR HHHHHHGGGRDIYATDYYRVGGRRR GST-TrkAiwt y GST-TrkAi-S671A In-gel kinase assay Arrays de kinasas comerciales Una vez identificada la kinasa: Interacción kinasa-sustrato (co-IP o cross-linking)

22 Survival Differentiation
¿Fosforilación basal o regulación por “feed-back”? TrkA NGF Y490 Y490 Grb-2 Ras PDK1 P P Shc Grb-2 Shc FRS-2 SOS Gab1 Raf-1 C3G PI3K Rap-1 B-Raf P Y785 Y785 P MEK1/2 S6K PLCg Akt endosome ERK1/2 DAG IP3 mTOR Ca2+ PKCd Survival Differentiation ER

23 Colaboradores Mass spectrometry analysis Prof Ole N Jensen
Dr Elisabetta Boeri-Erba Dr Anne J. Kleinnijenhuis Phospho-specific antibody production Dr Thorsten Wiederhold

24 Contenidos de Biología Celular en la licenciatura de Biotecnología
PROYECTO DOCENTE Ciències Mèdiques Bàsiques Universitat de Lleida Contenidos de Biología Celular en la licenciatura de Biotecnología Asignatura Ciclo Curso Cuatr. Carácter Créditos Biologia Celular º Troncal 6 Cultivos Celulares 2 3 2º Troncal 4,5

25 Objetivos específicos:
Cultivos celulares Ciències Mèdiques Bàsiques Universitat de Lleida OBJETIVOS FORMATIVOS Objetivo global: Conocimiento de las técnicas básicas de manipulación de las células en cultivo y sus aplicaciones en el campo de la biotecnología. Objetivos específicos: Conocer los principales tipos de cultivos celulares y de tejidos tanto vegetales como animales. Conocer los métodos de introducción de ADN exógeno en células en cultivo y saber cómo determinar qué método es el más adecuado. Conocer las principales aplicaciones del cultivo de células y tejidos tanto vegetales como animales.

26 Objetivos específicos:
Cultivos celulares Ciències Mèdiques Bàsiques Universitat de Lleida Objetivos específicos: Ser capaz de leer, entender y comunicar los resultados de un artículo científico sobre cultivos celulares. Ser capaz de iniciar un cultivo de células y de tejidos vegetales. Ser capaz de diseñar un medio nutritivo para el cultivo de células y tejidos vegetales. Ser capaz de descongelar y mantener en cultivo una línea celular de mamífero. Ser capaz de transfectar células en cultivo y de optimizar el protocolo de transfección para una línea celular determinada.

27 Descripción resumida de la actividad
Cultivos celulares Ciències Mèdiques Bàsiques Universitat de Lleida Temario teórico Tipo actividad Descripción resumida de la actividad Dedicación (horas) Objectivo formativo TEO Tema 1. Introducción y técnicas 1 Tema 2. Características y técnicas básicas de los cultivos vegetales Tema 3. Cultivos de órganos o fragmentos vegetales 3 Tema 4. Cultivo de células vegetales 2 Tema 5. Cultivos vegetales y transformación de plantas Tema 6. Aplicaciones de los cultivos in vitro vegetales Tema 7. Técnicas de manipulación de células animales en cultivo. Tema 8. Cultivos celulares especializados y técnicas asociadas. Tema 9. Sistemas de modificación celular. Tema 10. Biotecnología de tejidos. Tema 11. Biotecnología en células animales.

28 Descripción resumida de la actividad
Cultivos celulares Ciències Mèdiques Bàsiques Universitat de Lleida Temario práctico Tipo actividad Descripción resumida de la actividad Dedicación (horas) Objetivo formativo PRA Prácticas 1-3: Diseño de una unidad de cultivo de células y tejidos vegetales. Elaboración y preparación de medios de cultivo. Iniciación de un cultivo de tejidos vegetales 8 5-6 Práctica 4: Organogénesis y regeneración 2 Prácticas 5-7: Descongelación y puesta en cultivo de una línea celular. Ensayo de citotoxicidad. Transfección de células con PEI: optimización del protocolo. Congelación de células. 10 7-8 PRO Estudio de casos: cultivos vegetales 1 4 Estudio de casos: cultivos animales SEM Seminario: introducción y presentación Seminario: exposición y planteamiento de preguntas

29 FRESHNEY RI. 1999. Culture of animal cells. John Wiley & Sons. Ltd.
Cultivos celulares Ciències Mèdiques Bàsiques Universitat de Lleida BIBLIOGRAFIA Bibliografía básica: COLLIN HA, EDWARDS S Plant cell culture. Bios Scientific Publishers. GAMBORG OL, PHILLIPS GC Plant cell tissue and organ culture. Fundamental methods. Springer Verlag. TAJI A, KUMAR PP, LAKSHAMANAN P In vitro plant breeding. Food Products Press ALBERTS B, JOHNSON A, LEWIS J, RAFF M, ROBERTS K, WALTER P Biología Molecular de la Célula, 4ª edición. Editorial Omega, Barcelona. FRESHNEY RI Culture of animal cells. John Wiley & Sons. Ltd. SPECTOR DL, GOLDMAN RD, LEINWAND LA Cells: A Laboratory Manual. New York Cold Spring Harbor Laboratory Press cop.

30 Bibliografía complementaria:
Cultivos celulares Ciències Mèdiques Bàsiques Universitat de Lleida Bibliografía complementaria: GEORGE EF. Plant propagation by tissue culture. Part 1 (1993): The technology. 574p. Part 2 (1996): In practice. 799p. Exegetics Ltd., England. ENDRESS R Plants cell biotechnology. Springer Verlag. TRIGIANO RN, GRAY DJ. (Eds) Plant tissue culture concepts and laboratory exercises- CRC Press. Razdan M.K Introduction to plant tissue culture. Intercept. UK. LODISH H, BERK A, MATSUDAIRA P, KAISER CA, KRIEGER M, SCOUT MP, ZIPURSKY SL, DARNELL J Molecular Cell Biology, 5th edition. WH Freeman and Co., New York. (PubMed) KARP G Cell and Molecular Biology. Concepts and Experiments. 3rd Edition. John Wiley & Sons. Inc. New York BONIFACINO JS, DASSO M, LIPPINCOTT-SCHWARTZ J, HARFORD JB, YAMADA KM Current Protocols in Cell Biology. John Wiley & Sons. Ltd. WILSON L, MATSUDAIRA P. Methods in Cell Biology (series). Academic Press. MORGAN JR., YARMUSH ML Tissue engineering. Humana press.

31 Otras fuentes de información
Cultivos celulares Ciències Mèdiques Bàsiques Universitat de Lleida Otras fuentes de información The virtual library of Cell Biology: Lecture 15 - Gene Expression in Cultured Cells (Prof Roger L. Miesfeld) ECACC Handbook: Tissue culture Methods:

32 Diapositivas PowerPoint
Cultivos celulares Ciències Mèdiques Bàsiques Universitat de Lleida Metodología Clases teóricas: en las que los alumnos adquieren los conceptos básicos de la asignatura. Diapositivas PowerPoint Material disponible en la web de la UdL (dossiers electrónicos) Pizarra Análisis de casos: resolución de casos prácticos para la aplicación de los conceptos teóricos a situaciones reales Caso real expuesto por el profesor a resolver entre todos. Seminarios: lectura, comprensión y exposición oral de los resultados de un artículo científico sobre cutivos celulares. Ayudarán a fomentar el espíritu crítico y la expresión oral. Artículo científico a trabajar en grupos de 3 personas Prácticas de laboratorio: las prácticas permiten la consolidación de los conceptos teóricos adquiridos y enseña las bases para el trabajo en un laboratorio de cultivos. Manipulación individualizada de células en cultivo (grupos de 5 personas)

33 Examen escrito tipo test sobre la teoría y análisis de casos
Cultivos celulares Ciències Mèdiques Bàsiques Universitat de Lleida Evaluación Se valorará la adquisión de conocimientos, aptitudes y habilidades mediante: Examen escrito tipo test sobre la teoría y análisis de casos Valoración de la exposición oral del seminario Valoración del cuaderno de laboratorio de prácticas La nota final será: 70% conocimientos teóricos 15% seminario 15% cuaderno de prácticas