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REGULACION DEL RECEPTOR P2X7 POR FOSFORILACIÓN Mª Elena Hernández Álvarez. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular IV. Facultad de Veterinaria.

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1 REGULACION DEL RECEPTOR P2X7 POR FOSFORILACIÓN Mª Elena Hernández Álvarez. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular IV. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid.

2 RECEPTOR P2X7 Receptor ionotrópico de ATP. Proteína de 595 aminoácidos que posee un extremo C-terminal con 239 aminoácidos y un dominio hidrofóbico adicional. M1 M2 s s s s Extracelular Intracelular N C

3 Serin/treonin quinasa. Estructura: - dominio quinasa conservado. - dominio regulador variable. Se conocen 10 isoformas, que se clasifican en tres subfamilias: convencionales (cPKCs), noveles (nPKCs) y atípicas (aPKCs). PKC (Protein Kinase C) Steinberg; 2008

4 Regulación del receptor P2X7 por PKC Hung y cols.; 2005 Regulación negativa (A corto plazo) - La activación de la enzima PKC atenúa la señal de calcio mediada por Bz-ATP. - Los inhibidores de PKC restauran la señal de calcio. PKC- γ Co-inmunoprecipita

5 Determinar que residuos del receptor P2X7 son susceptibles de ser fosforilados por PKA ó PKC y así esclarecer la regulación de dicho receptor por las quinasas citadas. OBJETIVOS

6 SUBCLONAJE DEL RECEPTOR P2X7 Apa I P CMV P2X7 eGFP Neo r KpnI Apa I pEGFP-N1-P2X7-EGFP P CMV P2X7 IRES eGFP Kan r /Neo XhoI SmaI pP2X7-IRES-EGFP

7 VALIDACIÓN DE LA FUNCIONALIDAD DE LOS PLÁSMIDOS GENERADOS Electrofisiología. Registro de las corrientes iónicas de entrada en células HEK- 293T transfectadas con los plásmidos pEGFP-N1-P2X7-EGF y pP2X7-IRES-EGFP tras aplicar un pulso despolarizante de Bz-ATP.

8 VALIDACIÓN DE LA FUNCIONALIDAD DE LOS PLÁSMIDOS GENERADOS Microfluorimetría. Registro de los incrementos de Ca2+ intracelular en células HEK-293T transfectadas con el plásmido pEGFP-N1-P2X7-EGF y el plásmido pP2X7-IRES-EGFP, y estimuladas posteriormente con ATP 1mM y BZ-ATP 100μM.

9 2 Activador de PKC: PDBu (0.5 μM). Inhibidor de PKC: Estaurosporina (50nM). EXPERIMENTOS FARMACOLÓGICOS PDBu (0.5μM) Bz-ATP (100 μ M) Bz-ATP (100 μ M) Bz-ATP (100 μ M) Bz-ATP (100 μ M) Bz-ATP (100 μ M) Bz-ATP (100 μ M) Carbachol (100μM) PDBu (0.5μM) Estaurosporina (50nM) Bz-ATP (100 μ M) Bz-ATP (100 μ M) Bz-ATP (100 μ M) Bz-ATP (100 μ M) Bz-ATP (100 μ M) Carbacol (100 μ M) 30 20

10 Mutación de los sitios putativos de fosforilación por PKA y PKC Con objeto de estudiar la posible regulación del receptor P2X7 por PKA o PKC, decidimos mutar los sitios susceptibles de fosforilación por estas quinasas. Las distintas mutaciones puntuales se obtuvieron al intercambiar el aminoácido treonina por alanina en las posiciones 15, 397, 420, 510, 555 y 560 de la proteína.

11 Experimentos farmacológicos preliminares con inhibidores y activadores de PKC confirman los resultados obtenidos por Hung. Las modificaciones del extremo C-terminal del receptor P2X7 modifican tanto la cinética como la amplitud de las respuestas inducidas por él. CONCLUSIONES

12 PERSPECTIVAS FUTURAS Determinar si la funcionalidad del receptor P2X7 se ve regulada por procesos de fosforilación del extremo C- terminal. Pasos a realizar para comprobar nuestra hipótesis de trabajo: - Terminar de analizar la influencia de PKC sobre P2X7 mediante una aproximación farmacológica. - Comprobar si los mutantes generados del receptor P2X7 modifican la cinética de la respuesta inducida al activar dicho receptor. - Dado que se sabe que la inhibición del receptor P2X7 favorece la diferenciación neuronal, en caso de obtener resultados positivos, se procederá a determinar si la expresión de dichos receptores mutantes puede condicionar la diferenciación de células neuronales.

13 MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓN.


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