(Enzime Linked Inmunosorbent Assay)

Presentación del tema: "(Enzime Linked Inmunosorbent Assay)"— Transcripción de la presentación:

1 (Enzime Linked Inmunosorbent Assay)
ELISA (Enzime Linked Inmunosorbent Assay) Analisis de inmunoabsorción enzimática

2 ELISA Inmunología Clínica – Lab.
Técnica inmunoenzimática Basada en el marcaje de un antígeno o un anticuerpo con una enzima para su posterior detección. Ventajas de las técnicas inmunoenzimáticas Las enzimas poseen un bajo costo, se pueden purificar a partir de fuentes naturales comunes, tienen una aceptable estabilidad o vida útil, y no requieren de equipo muy especializado para la cuantificación de su actividad

3 El ELISA es empleado para
Inmunología Clínica – Lab. El ELISA es empleado para Detección de Antígenos ELISA sandwich ELISA competitivo Detección de Anticuerpos ELISA indirecto

4 ELISA SANDWICH Inmunología Clínica – Lab.
Se basa en unir a la fase sólida una capa de anticuerpos, que capturan el antígeno presente en el suero. Después de lavar el material no unido, el antígeno capturado se detecta mediante el uso de anticuerpos contra él, los cuales están conjugados directamente con la enzima indicadora. Es importante notar que el antígeno debe ser capaz de ser reconocido por al menos dos moléculas de anticuerpos simultáneamente, lo cual no es un problema cuando se utilizan anticuerpos policlonales. Sin embargo, si el ELISA está basado en el uso de anticuerpos monoclonales, es necesario utilizar dos anticuerpos distintos (que reconocen dos epitopos distintos), y que no interfieren entre sí para la unión simultánea al antígeno. Esta modalidad ha sido denominada ELISA "de dos sitios" (twosite ELISA) para indicar la distinta especificidad del par de anticuerpos monoclonales. Si el antígeno presenta un mismo epitopo repetido (y accesible) al menos dos veces, es posible usar el mismo anticuerpo monoclonal en la fase sólida y en la detección

5 La mezcla de Ag-Ac se añade a un foso recubierto con Ag.
Inmunología Clínica – Lab. ELISA COMPETITIVO En esta técnica se incuba el anticuerpo en solución con una muestra que contiene antígeno. La mezcla de Ag-Ac se añade a un foso recubierto con Ag. Cuanto más antígeno haya en la muestra, menos Ac habrá libre para unirse al Ag que recubre al foso. Se agrega un Ac. Secundario conjugado con la enzima para determinar la cantidad de Ac unido al foso. Cuando mas alta es la concentración de antígeno en la muestra original, mas baja es la absorción

6 Inmunología Clínica – Lab.

7 ELISA INDIRECTO Inmunología Clínica – Lab.
Se añade suero que se presume que contiene el anticuerpo a un foso recubierto con Ag. Se permite que el Ac reaccione con el Ag y se elimina por lavado cualquier anticuerpo no unido. El Ac unido al Ag se detecta por la adición de un segundo anticuerpo antiespecie secundario conjugado con enzima, que se une al anticuerpo primario. Se añade un sustrato para la enzima, y la canidad de productode la reacción de color se mide con lectores espectrofotométricos de placa.

8 Enzimas y sustratos empleados en inmunoensayos
Inmunología Clínica – Lab. Enzimas y sustratos empleados en inmunoensayos Peroxidasa (obtenida del rábano picante) y Fosfatasa alcalina (obtenida de mucosa intestinal bovina). Acopladas covalentemente a los anticuerpos sin perder su actividad catalítica, ni alterar la capacidad de unión de los mismos. Son estables durante largos períodos y catalizan reacciones simples que pueden generan productos coloreados, tanto solubles como precipitables.

9 Inmunología Clínica – Lab.
ELISA CUANTITATIVA Para las técnicas de cuantificación de antígeno, se utilizan patrones de concentración conocida del mismo, que se corren simultáneamente con las muestras, con el fin de trazar una curva de referencia. La absorbancia (color) obtenida guarda una proporción con la cantidad de antígeno presente en los estándares y las muestras. De esta forma, las lecturas de absorbancia son convertidas en unidades de masa (ej. pg/ml, ng/ml, etc.).

10 Curva para cuantificación de Antígeno
Inmunología Clínica – Lab. Curva para cuantificación de Antígeno

11 Curva para cuantificación de Antígeno
Inmunología Clínica – Lab. Curva para cuantificación de Antígeno

12 Inmunología Clínica – Lab.
ELISA CUANTITATIVA En el caso de cuantificación de anticuerpos es usual trabajar con unidades relativas o arbitrarias, sin una conversión a unidades de masa. Por ejemplo, se puede estimar la cantidad de anticuerpos mediante curvas de titulación, corriendo diluciones seriadas de cada muestra. El título puede definirse arbitrariamente de varias maneras. Una forma consiste en definir el título como la dilución que resulta en una absorbancia "X", dentro de la región central de la curva de titulación. Otra forma consiste en definir el título como la máxima dilución de la muestra que resulta en una absorbancia de 3 veces el valor de las muestras control negativas. Esta última definición utiliza la parte final de la curva de titulación, cerca del aplanamiento, por lo que está sujeta a una mayor variabilidad que la región central, utilizada en la definición anterior. Alternativamente, se puede comparar la absorbancia de las muestras con la de un suero patrón o "control", al cual se le ha asignado un valor de unidades arbitrarias

13 Curva para cuantificación de Anticuerpo
Inmunología Clínica – Lab. Curva para cuantificación de Anticuerpo

14 Inmunología Clínica – Lab.
KITS COMERCIALES

15 Inmunología Clínica – Lab.
Lector de ELISA

16 Aplicaciones DIAGNOSTICO DE INFECCIONES POR MICROORGANISMOS
Inmunología Clínica – Lab. Aplicaciones DIAGNOSTICO DE INFECCIONES POR MICROORGANISMOS DETECCION Y CUANTIFICACION DE ANTICUERPOS CUANTIFICACION DE METABOLITOS, HORMONAS, DROGAS, MEDICAMENTOS MONITOREO DE HORMONAS – TRATAMIENTO.