MALDI-TOF MS y Análisis de Proteínas

Presentación del tema: "MALDI-TOF MS y Análisis de Proteínas"— Transcripción de la presentación:

1 MALDI-TOF MS y Análisis de Proteínas
Curso Espectrometría de masas, Electrospray Trampa Iónica y Maldi-Tof UNIVERSIDAD FRANCISCO DE VITORIA MALDI-TOF MS y Análisis de Proteínas Alberto Jorge García Laboratorio de Proteómica Centro de Biología Molecular Severo Ochoa Universidad Autónoma de Madrid- CSIC

2 Identificación Proteína Identificación Péptido
Proteómica: Péptidos Proteoma BASE DE DATOS Fragmentos BASE DE DATOS Proteína Identificación Péptido

3 ESTRATEGIA INTEGRADORA PARA EL ANÁLISIS DEL PROTEOMA
SDS-PAGE Digestión “in situ” en paralelo Bandas de proteínas 2D-IEF-SDS-PAGE Extracto de péptidos mapa de péptidos MALDI-TOF Identificación de proteína m-desalado automático aislamiento y fragmentación Secuenciación “de novo” Electrospray-trampa iónica

4 Mapa de péptidos (MALDI-TOF) Extracto crudo digestión “en gel”
Intensidad m/z

5 Identificación de la proteína a partir del mapa de péptidos
(“peptide-mass fingerprinting”) Búsqueda en MASCOT (D.Pappin, ICRF, Londres) 1. gi| Mass: Score: 87 (M76598) alpha cardiac myosin heavy chain [Mus musculus] Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta Start End Miss Peptide ANSEVAQWR MFNWMVTR TLEDQANEYR LEAQTRPFDIR NNLLQAELEELR IEELEEELEAER DIDDLELTLAKVEK LQNEIEDLMVDVER ILNPAAIPEGQFIDSR DLEEATLQHEATAAALR HADSVAELGEQIDNLQR MEGDLNEMEIQLSQANR KMEGDLNEMEIQLSQANR LTQESIMDLENDKLQLEEK NDLQLQVQAEQDNLNDAEER ALQEAHQQALDDLQAEEDKVNTLTK DTQLQLDDAVHANDDLKENIAIVER No match to:

6 MALDI-TOF/MS Transfer into the gas phase (desorb) Ionize
Apply electromagnetic fields Analyse ion movements Determine m/z Detector Ion Source

7 MALDI-TOF/MS Time-of-Flight Molecular Mass Laser Sample Target Clock
Detector Time-of-Flight Molecular Mass

8 MALDI-TOF/MS matrix analyte sample solution dry samples
sample deposition insert target and perform analysis

9 Ionización/Desorción
Matrix for Proteins: sinapinic acid, dihydroxybenzoic acid etc. Matrix for Peptides: 4-hydroxy-a-cyanocinnamic acid, DHB. it co-crystallizes, absorbs laser energy, evaporates and acts as acid

10 Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization (MALDI)
+ Cationized analyte Analyte molecules Matrix molecules Laser beam Matrix molecules Matrix ions -explicar -prob choque dos veces con matriz es muy baja: carga 1 -dos características fundamentales: pulsante y carga 1+ -eficiencia depende de razón analito/matriz y forma de cristalización Cortesía de Bruker Daltonics

11 Tres niveles de preparación de muestras:
Sensibilidad normal: método estándar. Alta sensibilidad: método “anchor-chip” con matriz HCCA y cristalización homogénea de Bruker. Muy alta sensibilidad: método “anchor-chip” con matriz DHB y cristalización heterogénea.

12 Preparación de la muestra: anchor-DHB

13 Fundamentos del TOF -todo lo que entra se ve: alta eficiencia detección -potencialmente mucha resolución: depende de fuente de iones -comentar reflector, extracción pulsante

14 MALDI-TOF Linear detector Reflector detector Laser Reflector Source

15 Resolución isotópica

16 Voltaje de extracción

17 Extracción retardada

18 Extracción retardada

19 Decomposition occurs in the flight tube
Linear detector Reflector detector Laser Decay can occur at any point along here Reflector Source

20 Fundamentals of PSD PSD refers to a method of detecting and measuring the masses of fragment ions formed from a selected precursor ion during the flight time. Fragment ions are mainly formed by unimolecular decomposition after the precursor ions are fully accelerated (after they exit the source—hence post-source decay) Fragment ions are separated in the reflector.

21 PSD fragment ion velocities are the same as their precursors
+ All three of these species travel at the same velocity in the flight tube until they reach the mirror. + Why? Velocity is determined by initial acceleration. Initial energy = 20 keV. Bond energies = ~ 10 eV, so breaking a bond has a very minor effect on velocities.

22 Neutral fragments are not detected
Reflector detector Fragmented precursor ion + + 0 V. +20 kV Reflector

23 Fragment ions take different paths in the reflector
Reflector detector Intact precursor ion + + Fragment ion formed by PSD 0 V. +20 kV Reflector

24 PSD ISD