Electroforesis Método analítico para la separación y análisis de macromoléculas (DNA, RNA, Proteínas) y productos de su fragmentación, basándose en su.

Presentación del tema: "Electroforesis Método analítico para la separación y análisis de macromoléculas (DNA, RNA, Proteínas) y productos de su fragmentación, basándose en su."— Transcripción de la presentación:

1 Electroforesis SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

2 Electroforesis Método analítico para la separación y análisis de macromoléculas (DNA, RNA, Proteínas) y productos de su fragmentación, basándose en su carga y tamaño.

3 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS SDS-PAGE
Monitoreo de pasos de purificación Western- blots Determinación de masa molecular. · Verificación de la concentración de proteínas. · Detección de proteólisis. · Identificación de proteínas inmunoprecipitadas. · Separación de proteínas marcadas con isótopos radioactivos.

4 Tipos de electroforesis
PAGE nativa PAGE nativa de gradiente PAGE de Urea PAGE de SDS PAGE de SDS de gradiente IEF 2D PAGE Western blot

5 ELECTROFORESIS SDS-PAGE
SDS : dodecil sulfato de sodio: Detergente aniónico En la electroforesis SDS-PAGE el SDS se agrega en TODO!!!! 1. En el gel 2. En el buffer de muestra 3. En el buffer de corrida

6 Electroforesis SDS-PAGE
REACTIVOS UTILIZADOS Para hacer la matriz (el gel) Tetrametiletilendiamino (TEMED) N,Nʼ-metilen-bis-acrilamida Acrilamida Persulfato de amonio

7 ¿Cómo se forma la matriz (el gel)?

8 MATRIZ DE POLIACRILAMIDA
Fase líquida o un gel muy poroso Gel de poliacrilamida

9 Acrilamida Químicamente inerte
Estable en un amplio rango de pH, temperatura y fuerza iónica Insoluble en agua La matriz (el gel) se puede preparar de forma rápida y reproducible Se puede variar la concentración de acrilamida y bisacrilamida para modificar de manera controlada el tamaño del poro: MAYOR RESOLUCIÓN

10 Rango de separación (tamaño)
En esta técnica es posible modificar los porcentajes de acrilamida para obtener una mayor resolución % de Acrilamida Rango de separación (tamaño) 15% 15 – 45 kDa 12.5% 15 – 60 kDa 10% 18 – 75 kDa 7.5 % 30 – 120 kDa 5 % 60 – 212 kDa

11 ELECTROFORESIS SDS-PAGE
GELES CONCENTRADOR Y SEPARADOR Diferente pH Diferente % de Acrilamida GEL CONCENTRADOR Más poroso (2-5% acrilamida) pH Tris-HCl SDS GEL SEPARADOR Menos poroso (7-15% acrilamida) pH 8.8 Tris-HCl SDS BUFFER DE CORRIDA Tris/Glicina/SDS

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13 Se utilizan dos amortiguadores:
El buffer de corrida y el buffer de muestra El Buffer de corrida contiene 1. SDS 2. Tris-HCl 3. Glicina

14 Se utilizan dos amortiguadores:
El buffer de corrida y el buffer de muestra El Buffer de muestra contiene 1. Beta mercaptoetanol 2. Azul de bromofenol 3. Glicerol

15 ¿Cómo se consigue el efecto concentrador?

16 Resolución de proteínas

17 Movilidad electroforética
Velocidad de migración: parámetro característico de una molécula cargada. Depende de la pK de los grupos cargados y el tamaño de la molécula. Influencias: tipo de buffer, concentración y pH, la temperatura y el campo eléctrico ejercido, así como la naturaleza del material de soporte.

18 Marcadores de Peso Molecular preteñidos
¿Cómo vamos a visualizar las proteínas Marcadores de Peso Molecular preteñidos Frente de corrida

19 Los geles se pueden teñir con:
Azul de Comassie Plata (nitrato de plata)

20 ¿Cómo vamos a determinar el tamaño aproximado de las bandas obtenidas?
Con los estándares de peso molecular: obtenemos el RF

21 ¿Cómo vamos a determinar el tamaño aproximado de las bandas obtenidas?
Distancia total Frente de corrida

22 Gel obtenido por SDS-PAGE que muestra el progreso de una purificación exitosa

23 ¿Qué hacer en la práctica?
Preparar muestras con 50 µg en 20 µL (5 µL BC 4X) de cada fracción Desnaturalizar muestras: 80°C, 5 mins. Hacer SDS-PAG. Aplicar 10 µL/ pozo Correr SDS-PAGE: 120 V por 2 hr Sacar gel de cámara y teñir con azul de Coomassie por 1 hr Desteñir con agua O/N

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25 Tipos de electroforesis de proteínas
Nativa. No incluye SDS. Permite analizar proteínas con estructura terciaria y cuaternaria. 2D. Doble separación Primera dimensión: Por su punto isoeléctrico Segunda dimensión: por su tamaño.