FECUNDACIÓ IN VITRO DE L’ERIÇÓ DE MAR, protocol..

Presentación del tema: "FECUNDACIÓ IN VITRO DE L’ERIÇÓ DE MAR, protocol.."— Transcripción de la presentación:

1 FECUNDACIÓ IN VITRO DE L’ERIÇÓ DE MAR, protocol.

2 FECUNDACIÓ IN VITRO DE L’ERIÇÓ DE MAR
Objectius: 1. Realitzant aquesta activitat, aprendrem a: - Manipular utillatge típic d’un laboratori de biologia - Prendre les precaucions necessàries alhora de treballar amb organismes vius. 2. Realitazant aquesta activitat, veurem : - El procés de fecundació - El desenvolupament embrionari des de l’estadi d’ou fins l’estadi de larva

3 Vas de precipitats. (250 ml o més) Portaobjectes i cubres
Material que hem de tenir a punt : LABORATORI Vas de precipitats. (250 ml o més) Pipetes Pasteur Càpsules de Petri Portaobjectes i cubres Microscopi Eppendorfs amb les solucions de gàmetes Aigua de mar

4 L’escola del mar us proporcionarà:
* 2 eppendorfs: òvuls: marcat amb el símbol ♀ i amb la data d’extracció Cal mantenir-lo a temperatura ambient, (14 – 20 ºC) i preferiblement resguardat de la llum directa. espermatozoides: marcat amb el símbol ♂ i amb la data d’extracció Cal mantenir-lo a la nevera (4 ºC) *Aigua de mar Per garantir un bon resultat, és aconsellable fer la fecundació en els dos dies posteriors a la data d’extracció que consta en els eppendorfs

5 Protocol per veure els gàmetes i la fecundació
FECUNDACIÓ IN VITRO DE L’ERIÇÓ DE MAR Protocol per veure els gàmetes i la fecundació Amb aquest protocol podreu observar els gàmetes dels eriçons, tant els òvuls com els espermatozous, i la cèl·lula fecundada amb la membrana de fecundació. Per observar l’esperma: Agafeu una placa de Petri i afegiu-hi uns 15 ml d’aigua de mar. A continuació poseu-hi una gota d’esperma amb una pipeta Pasteur i barregeu lleugerament perquè l’esperma es dilueixi. Una cop feta la dilució agafeu-ne una gota i poseu-la en l’extrem d’un portaobjectes. Es podran observar els espermatozous a 400 augments. Tot i que serà difícil veure’n els detalls pel seu petit tamany, el que si es pot observar és el seu moviment, fins i tot, si està molt concentrat, amb l’objectiu de 100 augments.

6 Per observar els òvuls:
Per observar els òvuls només cal agafar-ne una gota amb una pipeta Pasteur i posar-la a l’altre extrem del portaobjectes on teníem la gota amb l’esperma. Si els òvuls estan molt concentrats i es volen diluir es pot fer una dilució com amb l’esperma, però aquest cop n’hi haurà prou amb fer-ho amb 10 ml. d’aigua de mar. Els òvuls es poden veure sense problemes amb 40 augments tot i que també es poden usar els objectius de 100 i 400 augments.

7 Per observar la cèl·lula fecundada:
Un cop observats òvuls i espermatozous podem unir les dues gotes fen un canal d’unió amb una agulla. Un cop unides les dues gotes l’esperma es dirigirà cap els òvuls i en qüestió d’un minut les cèl·lules es començaran a fecundar. Amb l’objectiu de 40 o 100 augments es podran veure les cèl·lules fecundades i les membranes de fecundació que la protegeixen. També es poden veure els núvols d’espermatozous al voltant de la membrana de fecundació que ja no poden penetrarar la cèl·lula fecundada. Membrana de fecundació ESPERMA ÒVULS ÒVUL FECUNDAT

8 Protocol per veure les diferents fases embrionàries
FECUNDACIÓ IN VITRO DE L’ERIÇÓ DE MAR Protocol per veure les diferents fases embrionàries Poseu 200 ml d’aigua de mar en un vas de precipitats Barregeu bé la solució d’oòcits, capgirant l’eppendorf de 10 a 20 vegades ♀, Amb una pipeta Pasteur, afegiu cinc gotes de la solució d’oòcits al vas de precipitats on hi teniu l’aigua de mar Els oòcits són cèl·lules grans i immòbils que sedimentaran al fons. Podreu observar-hi una fina pel·lícula de color ataronjat 5 o 10 minuts abans de fer-lo servir, treieu l’eppendorf amb l’esperma de la nevera.

9 FECUNDACIÓ IN VITRO DE L’ERIÇÓ DE MAR
Un cop estigui ben barrejat, afegiu una gota de la solució d'espermatozoides al vas de precipitats on abans hi heu afegit els oòcits. Els espermatozoides són cèl·lules mòbils que es distribuiran per tot el volum del vas de precipitats En el moment en què afegiu els espermatozoides comença el temps 0 A partir del temps 0 heu d’anar controlant el procés de fecundació i el posterior desenvolupament embrionari. Per fer-ho: a diferents intervals de temps, heu d’agafar, amb una pipeta neta, una gota de la solució que tenim en el vas de precipitats. Poseu la gota en un portaobjectes i després de posar-hi el cubreobjectes, observeu-la amb el microscopi òptic, a 100, 400 i 1000 augments

10 Factors a tenir en compte:
Aproximadament en les primeres 24 hores els embrions estan en fase immòbil raó per la qual és recomanable agafar la mostra del fons del vas de precipitats A partir de la fase de blàstula els embrions passen a ser mòbils i per tant en suspensió. Ara la mostra s’ha d’agafar de la columna d’aigua, però en haver passat d’un espai superficial (2 dimensions) a un volumètric (3 dimensions) la dispersió dels embrions serà més gran. Per això cal ser pacient si al principi no s’obté mostra. Sovint, si el número d’embrions en suspensió és quantiós, al contrallum se’n poden veure les acumulacions. Això ens pot donar una pista d’on agafar les gotes per veure els embrions. ATENCIÓ!!!! USEU SEMPRE AIGUA DE MAR. L’INSTRUMENTAL DE LABORATORI TAMBÉ HA DE SER ESVANDIT AMB AIGUA DE MAR. LA PRESÈNCIA D’AIGUA DOLÇA POT PROVOCAR SHOCKS OSMÒTICS I LA DESTRUCCIÓ DELS EMBRIONS. A continuació teniu una taula aproximada dels temps que han de passar per arribar a cada fase embrionària

11 Què observarem i quan? fons t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7 del mig T0 +48h
Larves Aberracions fons del mig t7 T0 +48h Gràstules t6 T0+24h Blàstules t5 T0+12h Mòrules Blàstules inicials aberracions t4 T0 + 6h 8 cèl·lules 16 cèl·lules t3 T0 + 3h 4 cèl·lules t2 T0 + 2h Oòcits no fecundats Oòcits fecundats 2 cèl·lules t1 T0 + 1h Oòcits Espermatozoides Pronuclis fecundació t0 fixat En viu Imatges Què podem veure ? D’on treiem la mostra? temps Què observarem i quan?

12 5 gotes 1 gota ♀ ♂ Aigua De mar 200 ml en el temps corresponent, agafeu una gota del vas de precipitats i poseu-la en un porta ti t0 MICROSCOPI OBSERVACIÓ RESUM GRÀFIC DEL PROTOCOL EN VIU

13 Si teniu dubtes o necessiteu algun aclariment poseu-vos en contacte amb el personal de l’Escola del Mar: Telèfons: Correu electrònic: